乳酸片球菌胞外多糖的分离纯化、结构分析及抗氧化活性研究

李尧,卢承蓉,刘丹,韩翔鹏,钟青萍

(华南农业大学 食品学院,广东 广州,510642)

多糖是由糖苷键连接,由10个以上单糖组成的高分子碳水化合物[1]。其结构复杂,种类繁多,在调节细胞生命活动过程中起着重要作用,与核酸、蛋白质和脂质一起被称为生命体的四大基础物质[2]。乳酸菌是公认安全(generally recognized as safe,GRAS)的微生物[3],所产胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)也被认为是安全无害的。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长和代谢过程中分泌到细胞外的多糖类化合物,可分为黏液多糖和荚膜多糖[4],两者结构相似,但荚膜多糖与细胞结合紧密,通过简单离心不能分离,通常所说的胞外多糖多为黏液多糖。根据结构和组成的不同,可分为同多糖(homopolysaccharide,HoPS)和杂多糖 (heteropolysaccharide,HePS)。同多糖的合成通常是在细胞外进行的,其组成简单,一般只由一种单糖组成;杂多糖的合成主要在细胞质中进行,其组成成分比较复杂,由不同种类的单糖或者单糖衍生物组成[5]。大多数乳酸菌产生的胞外多糖都是HePS,与HoPS相比,其结构复杂,包含不同比例的单糖,如鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等,有时还会出现糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺和一些非碳水化合物取代基如乙酸盐、丙酮酸等,它们可能对胞外多糖的益生功能起到关键作用[6]。

不同来源乳酸菌的胞外多糖有多种健康功效,如益生元的作用、调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤和降胆固醇等[7]。有关植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)等的胞外多糖的研究报道较多,对乳酸片球菌胞外多糖的研究较为少见,且大多集中研究益生效果,对其一级结构或者高级结构影响其益生特性的机制研究较少。本文对益生功能较好的1株乳酸片球菌C6菌株所产的胞外多糖进行分离纯化,分析其单糖组成,并进行了红外光谱测定和核磁共振分析,探讨胞外多糖结构与其抗氧化性能的关系,为乳酸菌胞外多糖作为天然抗氧化剂的研究和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高产胞外多糖的乳酸片球菌C6菌株,由本实验室分离鉴定和保藏。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sepharose CL-6B、透析袋、Tris,北京索莱宝科技有限公司;硫酸、苯酚, 广州化学试剂厂;岩藻糖(fucose,Fuc)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、盐酸氨基葡萄糖(glucosamine hydrochloride,Gah)、半乳糖(galactose,Gal)、葡萄糖(glucose,Glc)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,NAG)、木糖(xylose,Xyl)、甘露糖(mannose,Man)、果糖(fructose,Fru)、核糖(ribose,Rib)、3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(3-deoxy-D-manno-oct-2-ulsonic acid,Kdo)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA),上海源叶生物科技有限公司;焦性没食子酸,天津市北辰方正试剂厂;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[ 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS],美国Sigma公司。

MRS培养基:无水葡萄糖20.0 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏5.0 g/L,酵母粉4.0 g/L,吐温-80 1.0 mL/L,无水乙酸钠5.0 g/L,柠檬酸三铵 2.0 g/L,K2HPO4·3H2O 2.0 g/L,结晶MgSO40.2 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。终pH为6.0,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

ABTS工作液:将ABTS溶液(7.4 mmol/L)与等体积K2S2O8溶液(2.6 mmol/L)充分混合,置于黑暗条件下静置12 h后放入冰箱保存备用。每次使用前用PBS溶液(pH 7.4)稀释,使其OD734 nm为(0.7±0.02)。

1.2 仪器与设备

ESCO ClassⅡ生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司;ALPHA 2-4 LDplus冷冻干燥机,德国CHRIST公司;Avanti J-E落地式高速大容量离心机,美国Beckman Coulter公司;HH-4恒温水浴锅,常州智博瑞仪器制造有限公司;VersaMax光栅型酶标仪,美国Melecular Devices公司;1525高效液相色谱仪,美国Waters公司;ICS5000离子色谱仪,美国Thermo Fisher公司;Avance III HD核磁共振波谱仪,瑞士Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸片球菌EPS的提取

参考卢承蓉等[8]的方法并略作修改。将菌株按3%接种量接种于MRS培养基中,37 ℃恒温静置培养24 h,连续活化3次后于10 000 r/min离心10 min(4 ℃),弃去培养液中的菌体,取上清液并加入800 g/L三氯乙酸溶液,使溶液中三氯乙酸终质量浓度为4 g/L,在4 ℃冰箱中静置6～8 h后于10 000 r/min离心15 min(4 ℃),弃去蛋白质沉淀,取上清液,加入自身3倍体积预冷的乙醇(体积分数95%),在4 ℃冰箱中静置12～15 h后于10 000 r/min离心15 min(4 ℃),取多糖沉淀并加入去离子水溶解后移至透析袋中,截留分子质量8 k～14 kDa,用去离子水透析3 h后第1次换水,之后每隔8 h换1次水,持续2 d,收集透析液后进行真空冷冻干燥,即得到粗多糖。

1.3.2 乳酸片球菌EPS的分离纯化

1.3.2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析

Tris-HCl溶液平衡DEAE-Sepharose Fast Flow(2.6 cm×58 cm)离子交换层析柱过夜,0.1 g粗多糖溶于5 mL Tris-HCl溶液中,0.45 μm滤头过滤后上样,以含不同浓度NaCl(0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L)的Tris-HCl溶液作为洗脱液,流速1 mL/min进行梯度洗脱,每8 mL收集1管,以硫酸-苯酚法[9]检测多糖含量,测定其OD490 nm。以管数为横坐标,OD490 nm为纵坐标,作洗脱曲线。根据洗脱曲线收集每一个单一峰,在减压条件下浓缩,用去离子水透析2 d,真空冷冻干燥。

1.3.2.2 Sepharose CL-6B 分子筛层析

Tris-HCl溶液平衡Sepharose CL-6B(2.6 cm×60 cm)层析柱过夜,取经离子交换层析后的多糖样品0.1 g溶于1 mL Tris-HCl溶液中,0.45 μm滤头过滤后上样,以Tris-HCl溶液作为洗脱液,流速0.5 mL/min进行洗脱,每8 mL收集1管,硫酸-苯酚检测多糖含量,测定其OD490 nm。以管数为横坐标,OD490 nm为纵坐标,作洗脱曲线。根据洗脱曲线收集每一个单一峰,在减压条件下浓缩,用去离子水透析2 d,真空冷冻干燥。

1.3.3 乳酸片球菌EPS纯化组分的抗氧化活性

1.3.3.1 对DPPH自由基的清除能力

At:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液与1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液;Ar:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液与1 mL无水乙醇;A0:1 mL无水乙醇与1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液。配制A0、At、Ar这3种溶液,分别充分混匀后在常温黑暗条件下静置30 min,测其OD517 nm。按公式(1)计算DPPH自由基的清除率:

(1)

式中:At、Ar、A0分别为相应溶液的吸光度(下同)。

1.3.3.2 对ABTS阳离子自由基的清除能力

At:60 μL 8.0 mg/mL EPS溶液与3.0 mL ABTS工作液;Ar:60 μL 8.0 mg/mL EPS溶液与3.0 mL K2S2O8溶液;A0:60 μL去离子水与3.0 mL ABTS工作液。配制A0、At、Ar这3种溶液,分别充分混匀后置于30 ℃的恒温水浴锅中反应5 min,测其OD734 nm。按公式(2)计算ABTS阳离子自由基的清除率:

(2)

1.3.3.3 对·OH的清除能力

At:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液、1 mL 9.0 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇与1 mL 8.8 mmol/L H2O2;Ar:将At中H2O2溶液替换成去离子水;A0:将At中EPS溶液替换成去离子水。配制A0、At、Ar这3种溶液,分别充分混匀后置于37 ℃的恒温水浴锅中反应30 min,测其OD510 nm。按公式(3)计算·OH的清除率:

(3)

(4)

1.3.4 乳酸片球菌EPS纯化组分的结构分析

1.3.4.1 相对分子质量测定

纯化后EPS的相对分子质量(Mw)测定采用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)进行测定。取0.5 mg的样品溶解于1 mL超纯水中,0.22 μm滤膜过滤后进行GPC检测。采用不同相对分子质量的标准葡聚糖制作标准曲线,以保留时间为横坐标,lgMw为纵坐标。

GPC条件:采用PL aquqgel-OH MI×ED(250 mm×4.6 mm,8 μm)色谱柱,2414示差折光检测器,以0.2 mol/L NaNO3、0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7)为流动相;柱温30 ℃;进样量10 μL;流速1 mL/min进行洗脱。

1.3.4.2 单糖组成分析

EPS单糖定性分析:通过对比样品与单糖标准品的出峰时间来确定EPS纯化组分的单糖组成。取各样品4 mg于安瓿瓶中,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸,120 ℃水解3 h。准确吸取200 μL酸水解溶液转移至1.5 mL EP管中氮吹吹干,加入1 mL水涡旋混匀,12 000 r/min离心5 min后取上清液,采用离子色谱仪分析。

分析条件:采用Dionex CarbopacTMPA20色谱柱(3 mm×150 mm);电化学检测器;进样量5 μL;以A:H2O,B:250 mmol/L NaOH,C:50 mmol/L NaOH和500 mmol/L 乙酸钠作为流动相,进行三元梯度洗脱;柱温30 ℃;流速0.3 mL/min。

1.3.4.3 红外光谱测定

取2 mg EPS和200 mg KBr充分混合研磨均匀,压片机压片,以空白KBr为空白,调整基线,扣除背景干扰,透射模式测定,扫描次数为32,红外光谱分辨率为4 cm-1,4 000～400 cm-1扫描。

1.3.4.4 核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析

取5 mg EPS中加入0.5 mL重水,超声至完全溶解后,于500 MHz Bruker Avance III HD型核磁共振波谱仪进行分析,以四甲基硅烷为内标,室温测定EPS的1H NMR、13C NMR。

2 结果与分析

2.1 乳酸片球菌EPS的分离纯化

2.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化EPS

经粗提的EPS为混合多糖,含有其他杂质,需对其进一步分离纯化。DEAE-Sepharose Fast Flow是一种弱阴离子交换介质,适用于中性多糖、酸性多糖的分离[10]。图1所示,粗EPS经不同浓度的Tris-NaCl洗脱后共得到5个多糖组分,将其中3个含量较多的组分分别命名为EPS1、EPS2、EPS3。

图1 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化EPSFig.1 DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography of EPS

EPS1由Tris-HCl洗脱得到,可知EPS1不带电荷,为中性多糖;EPS2、EPS3分别由含NaCl浓度为0.1、0.3 mol/L 的Tris-HCl洗脱得到,因此这2个组分带负电荷,可知它们为酸性多糖或含有酸性基团的糖类复合物[11]。

2.1.2 Sepharose CL-6B分子筛层析纯化EPS

经离子交换层析后可得到电荷性质相近的多糖组分,但其分子质量可能不同,因此还需进行下一步分离纯化。琼脂糖凝胶CL-6B的排阻极限为1×104～4×106Da,适用于多糖组分的进一步分离纯化。由图2可知,3个多糖纯化组分经分子筛层析后,EPS2、EPS3得到比较对称的单一尖锐峰,由此可知EPS2和EPS3均为分子质量大小均一的单一组分。

图2 EPS1、EPS2、EPS3的Sepharose CL-6B分子筛层析Fig.2 Sepharose CL-6B molecular exclusion chromatography for EPS1,EPS2,EPS3

2.2 乳酸片球菌EPS纯化组分的抗氧化活性分析

图3 EPS纯化组分的抗氧化活性测定Fig.3 Antioxidant activities of the EPSs

2.3 乳酸片球菌EPS的结构分析

2.3.1 EPS纯化组分的相对分子质量测定

使用GPC测定EPS的相对分子质量。用不同相对分子质量的标准葡聚糖来制作标准曲线,得到回归方程y=-1.061 7x+12.896 8,R2=0.993 1。EPS2、EPS3的保留时间分别为8.116 7、8.000 0 min,代入标准曲线方程,计算得到其分子质量分别为1.90×104、2.53×104Da。

乳酸菌EPS的分子质量通常在1×104～4×106Da[12],EPS的分子质量、糖苷键构型对物理活性及益生功能有着重要影响。分子质量较低的EPS具备更好的水溶性及相对更加舒展的糖链构象,从而具备更好的生物活性[13]。

2.3.2 EPS纯化组分的单糖组成分析

采用14种单糖为标准品,以离子色谱仪分析EPS纯化组分的单糖组成,结果如图4所示,2.18 min及40.45 min处分别为NaOH及乙酸钠的峰;EPS2主要由木糖组成,另有少量的盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖,其摩尔比为0.912∶0.016∶0.022∶0.051;EPS3则由盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为0.105∶0.231∶0.471∶0.170∶ 0.010∶0.013。

乳酸菌的EPS多为HePS,其单糖成分多为葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖等[14],其中葡萄糖与半乳糖为乳酸菌EPS中最常见的单糖,这可能与培养基的成分有关[15]。本文中乳酸片球菌C6的EPS2单糖组分主要为木糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖及葡萄糖,而EPS3的单糖组分主要为盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸,其中半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸为乳酸菌EPS中常见单糖组分。LIU等[16]分析1株植物乳杆菌的EPS,发现其主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸及葡萄糖组成;WANG等[17]发现植物乳杆菌KX041在MRS肉汤培养基中产生的EPS由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。而盐酸氨基葡萄糖在乳酸菌EPS单糖组分中则少见报道,这种组分目前可以用来预防和治疗关节炎,对EPS3益生功能的多样性有待进一步研究。EPS的抗氧化能力与糖醛酸的含量相关[18],EPS3的抗氧化能力强于EPS2可能是因为其含有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸成分。

a-单糖标准品,b-EPS2,c-EPS3图4 单糖标准品及EPS的离子色谱图Fig.4 Ion chromatogram of monosaccharide standards and EPSs

2.3.3 EPS纯化组分的红外光谱分析

对纯化EPS进行红外光谱扫描,探究其主要官能团组成,结果如图5所示。

a-EPS2;b-EPS3图5 EPSs的红外光谱扫描图Fig.5 Infrared spectrum scan of EPSs

2.3.4 EPS纯化组分的NMR分析

2.3.4.1 EPS纯化组分的1H NMR分析

EPS的1H NMR可分为3个区域:δ4.5～5.5 信号为异头质子区,δ3.1～4.5 为环质子区域,对应于C2～C6连接的质子,δ1.2～2.4 为烷基区[25-26]。EPS在1H NMR中的质子信号范围很窄,且存在耦合和裂分,因此无法确认所有质子的化学位移,一般α-吡喃糖的异头氢质子信号δ>4.95,而β-吡喃糖的异头氢质子信号δ<4.95,因而1H NMR的谱图主要用于确认EPS的糖苷键构型。

图6分别为EPS2、EPS3的1H NMR谱图,5.4处无信号,表明所有糖残基均属于吡喃糖,与红外光谱保持一致。4.80、4.79 处的强峰为重水产生的吸收峰,此外EPS2、EPS3在4.5～5.5 分别出现6、7种异头氢质子信号,其信号分别为5.31、5.15、5.13、5.10、5.05、4.91 及5.46、5.42、5.31、5.23、4.67、4.66、4.52,2种EPS组分中糖苷键构型均含有α构型、β构型。1H NMR的环质子区域(3.1～4.5)信号堆叠,证实了EPS结构复杂,有研究表明D-葡萄糖羰基氢在3.53 处为三重态(t),在3.57和3.75 处具有双-双态(dd)信号,在3.92和3.96 处为双重dubletos(dl)[27]。HePS中通常会同时存在α和β构型,EPS的构型对其益生功能起重要作用,LI等[28]研究中,β构型糖苷键的EPS具有更强的抗癌作用,此外,与α-(1→4)键相比,具β-(1→4)键EPS溶液的黏性更大[6]。

a-EPS2-b-EPS3图6 EPSs的1H NMR谱图Fig.6 1H NMR spectrum of EPSs

2.3.4.2 EPS纯化组分的13C NMR分析

EPS的13C NMR谱图包括异头碳区域(95～110)、环碳区域(50～85)[29]。在13C NMR光谱中,δ95～101的峰主要是由于α-异头碳引起的,而δ101～105主要归因于β-异头碳[30],所以13C NMR光谱主要用来确定EPS的糖苷键类型及构型。

图7分别为EPS2、EPS3的13C NMR谱图。2种EPS的异头碳区域分别有7、6种异头碳信号,分别为102.19、102.01、100.78、100.54、98.22、98.08及109.20、108.54、106.62、103.04、102.78、101.14、95.29,表明EPS2、EPS3分别含有7、6种糖残基,2种EPS均含有α-异头碳、β-异头碳,与1H NMR的结果一致。EPS2在160～180处没有信号,表明其不含糖醛酸,而EPS3在160～180处的低信号表明其含有糖醛酸,这与单糖组成分析结果一致。2种EPS在90处均无明显信号,表明其不含呋喃环构型[31]。

a-EPS2;b-EPS3图7 EPSs的13C NMR谱图Fig.7 13C NMR spectrum of EPSs

3 结论