肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及在高通量抗体筛选中的应用

崔 珂 孔亚茹 马传敏 张振杰 史卫峰 全传松

山东第一医科大学（山东省医学科学院）基础医学院病原生物学系，山东济南 250014

肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）属于小RNA 病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属。EV71 主要感染5 岁以下儿童，是导致重症手足口病（hand，foot and mouth disease）最常见的病毒类型之一［1］。手足口病患者在临床上表现为手、足、口部疱疹，咽峡炎等症状；少数重症患者甚至出现心肌炎、脑膜炎或弛缓性麻痹等多种并发症［2］。根据法定传染病报告显示，2020 年中国大陆共报告手足口病761 355 例，死亡3人，发病率为54.233 6/10万［3］。该病毒持续引起国内外公共卫生领域的广泛关注，然而其防治仍未取得重要进展［4］。

肠道病毒71 型可编码VP1 ～VP4 4 种结构蛋白和7种非结构蛋白［5-6］，其中VP1 ～ VP3位于病毒衣壳表面。目前已证实VP1 的线性表位免疫原性较强，可有效刺激机体产生中和抗体［7-8］。在病毒感染过程中，机体通过体液免疫来阻止病毒的传播，这在抗EV71 感染过程中发挥重要作用［9］。本研究选取EV71 抗原性强的VP1 蛋白，将其基因克隆至原核表达载体pET-21a（+）中，利用IPTG 诱导VP1蛋白在大肠埃希菌中融合表达，以纯化的重组蛋白作为抗原，结合流式细胞术分选已免疫灭活病毒小鼠的B 淋巴细胞，这为筛选高效活性的抗EV71 抗体奠定了基础，为临床疾病的诊断和治疗提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

EV71 毒株KY315729、原核表达载体pET-21a（+）均由实验室保存；感受态细胞BL21-DE3购自北京康为世纪公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；IPTG购自索莱宝生物科技有限公司；Superdex 75购自 GE 公司；6×His 抗体购自上海生工；GSSG 购自Amresco；弗式完全佐剂及弗氏不完全佐剂均购自Sigma；红细胞裂解液购自索莱宝；CD19 PerCp-Cy5.5购自BD；Anti-his APC荧光抗体购自美天旎。

1.2 原核表达载体

pET-21a（+）-VP1 的构建：将EV71基因进行密码子优化后，由苏州金唯智生物公司进行合成，并克隆到pET-21a上（双酶切位点：5′BamHI和3′XhoI）。

1.3 重组VP1蛋白的表达、提取及纯化

1.3.1 包涵体提取 将重组质粒pET-21a（+）-VP1转化到BL21-DE3 感受态细胞中，挑取单个菌落于37 ℃培养至对数生长期，加入1000 mM IPTG，并在37 ℃、4～6 h 条件下诱导蛋白表达。经离心和超声破碎菌体后，取沉淀进行洗涤、离心、重悬，用SDSPAGE及Western blot鉴定其包涵体纯度。

1.3.2 目的蛋白的复性纯化 根据等电点分析，摸索确定最佳复性pH。将包涵体滴加到复性缓冲液（100 mM Tris-HCl、400 mM L-Arg HCl、2 mM EDTA、5 mM GSH、0.5 mM GSSG、0.5 mM PMSF）中4 ℃过夜。将复性液浓缩、离心后取上清加入AKTA纯化仪中，用分子排阻色谱法纯化，收集蛋白并分析峰图。

1.4 小鼠免疫

将灭活病毒（56 ℃，30 min）用等量的弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射方式，免疫6～8周龄昆明小鼠5只。初次免疫14天和28天后再次免疫，免疫剂量与初次免疫相同，但用弗氏不完全佐剂。第3次免疫后14天取脾脏，采用红细胞裂解的方式制备小鼠脾淋巴细胞悬液，纯化后的细胞冻存至液氮中备用。

1.5 EV71 VP1特异性B细胞的检测

利用制备好的EV71 VP1 蛋白分析小鼠脾脏特异性B 淋巴细胞。首先复苏冻存的脾细胞，计算出VP1 及抗体用量；再向脾细胞中加入VP1 蛋白，4 ℃避光孵育 30 min；后用 CD19 和 Anti-his 抗体标记细胞，4 ℃避光孵育30 min；最后用AF700荧光染料标记出死细胞，借助BD FACS AriaⅢ流式细胞仪对细胞进行检测，结果通过FlowJo-V10软件分析。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 20.0 统计软件进行统计分析，计量资料组间比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 原核表达载体 pET-21a（+）-VP1 的构建

将EV71 VP1 基因密码子优化后合成，并构建到pET-21a。酶切后的目的基因与预期结果片段大小相符（双酶切位点为Scal 和Xhol）（图1），测序分析序列正确。

图1 限制酶切电泳结果

2.2 重组VP1蛋白的表达、纯化和鉴定

2.2.1 包涵体提取 将重组表达载体pET-21a（+）-VP1 转化到表达宿主BL21-DE3 中，加入1000 mM IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE鉴定，重组VP1蛋白以包涵体形式表达。取沉淀洗涤、离心、重悬后，经SDS-PAGE 及Western blot 验证发现，存在大小约为37 kDa 的目的条带，与重组蛋白VP1 的大小相符，即包涵体成功提取（图2）。

图2 包涵体SDS-PAGE分析

2.2.2 目的蛋白的复性纯化与抗原性验证 经试验摸索，EV71 VP1蛋白最佳复性pH为7.9。利用分子排阻色谱的方法，将复性的包涵体纯化，收集目的蛋白并分析峰图。纯化VP1重组蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示，单一目的条带清晰可见，说明纯化效果好。测定蛋白质浓度为0.16 mg/mL，将其置于－80 ℃保存。将所提取重组蛋白通过Western blot进行抗原性验证，一抗为6×His抗体时（如图4A），与对照相比，重组蛋白在37 kDa附近存在目的条带，即EV71 VP1蛋白成功提取。当一抗为免疫小鼠血清时（如图4B），与未诱导菌相比，重组蛋白在37 kDa左右出现特异性条带，大小与预期相符，证明所提取的重组蛋白能够和免疫小鼠的血清发生特异性反应。

图3 纯化蛋白收集的峰图和鉴定

图4 重组蛋白抗原性分析

2.3 EV71 VP1特异性B细胞的检测

利用流式细胞仪对免疫组和PBS 组目的细胞亚群检测发现，灭活病毒免疫小鼠的脾脏细胞中CD19及Anti-his双阳性的细胞比例比PBS对照小鼠高（图5A），免疫组阳性率平均为1.67%，而PBS 组仅为0.68%（P＜ 0.001）（图5B），这表明灭活病毒免疫小鼠脾脏中病毒特异的B细胞比例显著增加。

图5 EV71 VP1特异性B细胞的检测

3 讨 论

EV71 引起的手足口病是一种常见的急性传染病，发病率高，传播快，流行广，严重危害公众健康［10-11］。但目前临床无特异性的治疗方法，EV71 传播过程和病理学的细节也尚未完全明确［12］，如EV71 感染过程中存在的抗体依赖的增强作用具体机制尚不清楚［13］。目前许多研究证实EV71 VP1 蛋白与入侵宿主和抗体中和相关［14-16］，VP1 结构蛋白具有良好的抗原性。除此之外，该蛋白的改变还与病毒的毒力和致病性密切相关。基于此，本实验将EV71 VP1 核酸序列进行密码子优化，合成并构建到重组表达载体pET-21a，后将其转化到表达宿主BL21-DE3 中。通过优化重组蛋白表达和复性的条件，确定IPTG 诱导的最佳条件为1000 mM IPTG，最佳复性pH 为7.9。本实验利用稀释复性及分子排阻色谱的方法，将复性的包涵体纯化，并进行抗原性验证。结果表明，所制备的重组VP1 蛋白能够和病毒免疫小鼠的血清反应，即具有良好的抗原性。利用EV71 VP1 蛋白检测灭活病毒免疫小鼠脾脏病毒特异B 细胞，结果显示该病毒特异性B 细胞比例显著增加。该制备的抗原蛋白与流式检测相结合，分选免疫动物或者病毒感染患者体内特异性浆细胞，为获得抗体轻重链的序列奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突