益气祛痰针法调控肥胖小鼠肠道运动和肠神经递质机制研究*

董小君，甘 媛，蔡明星，夏修文，陈桥桥,3，丁 斗,**

(1.遵义医药高等专科学校 中医学系，贵州 遵义 563006;2.成都中医药大学 基础医学院，四川 成都 610075;3.内江卫生与健康职业学院 基础医学部，四川 内江 641000)

ENS(Enteric nervous system, ENS)是位于肠壁的内在神经，由肠系膜和黏膜下神经丛两个网络组成，被认为是自主神经系统除交感神经和副交感神经外的第三部分。黏膜下神经丛中的神经回路负责协调肠道分泌物；而肠系膜神经丛主要负责协调肠平滑肌的收缩和松弛，这些收缩和松弛涉及肠道运动模式。胃肠功能的适当调整要求两个神经丛保持完整，并与靶细胞保持健康的相互作用[1]。肠道运动反射包括调节胃排空，肠道传输速率[2]和促进营养吸收的消化生理过程，均由ENS神经元调节。ENS可通过释放相应的神经递质来影响兴奋性和抑制性神经元，控制肠道平滑肌的收缩和放松，帮助肠道吸收和消化营养物质。国外研究表明，饮食不均衡且热量过多参与ENS的改变，导致肥胖发生。肥胖在中医上属虚实夹杂、本虚标实之证，实者主责之痰，虚者主责之脾[3]。采用益气祛痰针法，可以振奋脾阳，升清降浊，除湿化痰，达健脾益气、祛痰除湿之效，提高脾胃运化功能，积极调动脏腑各组织器官协调运作，减少痰湿脂膏积聚，促进脂质代谢，降脂减肥[4]。以往的研究主要集中在单纯电针改善肠道运动的中枢和外周神经通路的作用上，对ENS的作用和机制还没有深入的研究。本实验将研究益气祛痰针法如何整体调控肥胖小鼠ENS，影响肠道的运动和消化吸收。

1 材 料

1.1 实验动物

8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠90只，体重(21.09±0.72)g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2015-030。本实验方案通过成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，遵循实验动物伦理委员会指导原则。

1.2 材料和仪器

南京建成生物工程研究所提供的总胆固醇(CHO)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、HDL-C试剂盒和LDL-C试剂盒(批号：20181009)，5-HT试剂盒、P物质试剂盒、VIP试剂盒(批号：20181203)，BLUEGREN公司提供的瘦素(LP)试剂盒(批号：E03A0038)、脂联素(ADPN)试剂盒(批号：E03A0125)，华佗牌G6805-Ⅲ型电针仪、一次性针灸针(苏州天协针灸器械有限公司)、转轮式切片机(徕卡-2016，德国)、TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)、数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)、图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)等。

2 治疗方法

2.1 造模方法

90只C57BL/6J实验小鼠置于成都中医药大学基础医学院实验中心动物房内进行饲养，恒定温度为(23±2)℃，相对湿度为(50±2)%。光照-黑暗周期各半，8:00～20:00开灯，20:00～8:00关灯。小鼠每笼5只，采取自由获取食物和水的方式。用高脂饲料喂养10周，配方为猪油32 %，酪蛋白26 %，麦芽糖糊精16 %，蔗糖9 %，纤维素6 %，其他11 %，购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号：SCXK(京2014—0008)。每周定期测量小鼠的体重和体长，第8周开始评价模型，筛出体重大于同时间点正常组体重的20 %，且Lee's指数大于正常组平均Lee's指数20 %的肥胖小鼠40只，造模成功率约为 51.30 %。随机分为模型组、电针治疗14 d组、电针治疗21 d和电针治疗28 d组。

2.2 分组及干预方法

造模成功后在未做任何处理的12只正常小鼠中，随机选取10只作为空白对照组(N组)，将40只肥胖小鼠随机分为模型组(M组)、电针干预14 d组(A 14组)、电针干预21 d组(A 21组)和电针干预28 d组(A 28组)，每组10只动物。电针干预组(A 14、A 21和A 28)所选穴位参照余曙光、郭义主编的2016版《实验针灸学》，斜刺天枢3 mm，斜刺关元3 mm，直刺足三里3 mm，直刺三阴交3 mm，行益气祛痰针法，得气后，接通华佗牌G6805-Ⅲ型电针仪，选择疏密波，强度2 mA，以局部轻微抖动为度，留针10 min，每日1次，左右交替取穴，正常组与模型组以相同方式固定10 min，不予针刺干预。

2.3 指标检测

2.3.1 益气祛痰针法对实验小鼠体重、Lee's指数、血脂和肥胖因子的影响

每周定期测量体重和体长，依公式计算Lee's指数：体重(1/3)×1 000/体长。干预结束后，禁食不禁水8 h以上，采用摘眼球取血，分离血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清CHO、TG、LP和ADPN含量，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.3.2 益气祛痰针法对实验小鼠小肠传输率(ITR%)的影响

制备出5 % 浓度的活性炭阿拉伯明胶悬混液，以0.01 mL/g体重的剂量进行灌胃。活性炭悬混液给药30 min后处死实验小鼠。通过活性炭在肠中迁移的长度，从幽门到其最远端的距离来测量小肠传输能力。用活性炭的移动距离占小肠总长度的百分比来估算ITR%值。ITR%=碳末从幽门传输其最远端距离(cm)/小肠总长度(cm)×100 %。

2.3.3 益气祛痰针法对实验小鼠肠神经HE病理的影响

固定小肠经全自动脱水机脱水，包埋，切片后如下操作：切片脱蜡至水，苏木精染色10 min～20 min，自来水冲洗1 min～3 min，盐酸酒精分化5 s～10 s，自来水冲洗1 min～3 min，放入50 ℃的温水中或弱碱性水溶液返蓝，直到出现蓝色为止，自来水冲洗1 min～3 min，放入85 %的酒精3 min～5 min，伊红染色3 min～5 min，水洗3 s～5 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，以上标本均按病理检验SOP程序进行。脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后镜检。

2.3.4 益气祛痰针法对实验小鼠空肠组织SP、5-HT和VIP含量影响

干预结束后，禁食不禁水8 h以上，无菌条件下打开腹腔，理出小肠。空肠组织匀浆后用ELISA法检测空肠组织中的5-HT、VIP和P物质的含量。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法

3 结 果

3.1 益气祛痰针法对实验小鼠体重和Lee's指数的影响

采用益气祛痰针法电针干预后，益气祛痰针法干预各组体重均值都极显著低于肥胖模型组(P<0.001)。益气祛痰针法干预各组比较，A 21组体重均值极显著低于A 14组(P<0.001)，A 28组体重均值显著低于A 14组(P<0.01)。Lee's指数可以衡量肥胖程度，与普通饮食组比较，肥胖模型组的指数最高，有极显著性差异(P<0.001)。经干预后，益气祛痰针法各组的Lee's指数与肥胖模型组相比都出现极显著性下降(P<0.001)。干预的不同时间所对应的Lee's指数具有统计学差异，与干预14 d比较，益气祛痰针法干预21 d和28 d的指数显著下降(P<0.01)。见表1。

表1 益气祛痰针法对各组实验小鼠Lee's指数的影响

3.2 益气祛痰针法对实验小鼠血脂和肥胖因子的影响

如图1(A)所示，M组血脂四项中的CHO和TG含量极显著高于N组(P<0.001)，但肥胖模型实验鼠的HDL-C含量极显著低于普通饮食实验鼠(P<0.001)。经益气祛痰针法干预后，与M组相比，干预各组的CHO明显降低(P<0.01)，干预各组的TG下降尤为明显，具有极显著性差异(P<0.001)，且益气祛痰针法干预21 d和28 d与干预14 d比较，差异具有统计学意义。血脂中的HDL-C经益气祛痰针法干预后，只有A 21组和A 28组的含量上升，与M组相比有极显著性差异(P<0.01)，各干预组组间与A 14组比较，仅A 21组出现显著性差异(P<0.05)。

血清瘦素如图1(B)所示，与N组比较，M组血清含量显著性升高(P<0.001)。经电针干预后，和M组对比，益气祛痰针法各组血清含量均降低，A 14有极显著性差异(P<0.01)，而A 21组和A 28组的干预差异更明显(P<0.001)。

血清脂联素方面图1(C)，与N组比较，M组血清含量最低，有显著性差异(P<0.001)。经益气祛痰针法干预后，电针干预各组血清含量逐渐上升，和M组相比有极显著性差异(P<0.001)，并呈时间干预依赖性，与A 14组比较，A 21组和A 28组的血清含量上升有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组实验小鼠血脂和脂肪因子含量

3.3 益气祛痰针法对实验小鼠ITR的影响

如图2所示，普通饮食组实验小鼠ITR(86.46±3.17)最快，与肥胖模型组(65.03±4.71)相比有极显著性差异(P<0.001)。益气祛痰针法治疗后，各电针干预组的ITR增快，与肥胖模型组比较，有极显著性差异(P<0.001)。益气祛痰针法干预21 d(76.79±2.57)和28 d(77.28±3.66)，同干预14 d(72.98±4.55)比较，具有统计学差异(P<0.05)。

图2 各组实验小鼠小肠传输率(ITR%)

3.4 益气祛痰针法对实验小鼠肠神经病理HE病理的影响

如图3(A)所示，普通饮食组实验小鼠的神经纤维肌层肌纤维排列整齐，在肠壁肌层环肌和纵肌之间可见大量的神经纤维，神经纤维排列致密，肌层之间未见明显的间隙，神经纤维相对肌层组织透光度较强，着色偏浅，神经纤维未见明显的病理变化。肥胖模型实验小鼠肌纤维水肿、变性，排列紊乱，透光度增强，细胞核碎裂或溶解消失，横肌和纵肌分界不明显，神经纤维结构不清晰，神经细胞数量减少，纤维排列紊乱，神经细胞核大小不一，形态不规则。益气祛痰干预各组神经纤维出现局灶性的病变，局灶性神经纤维水肿，间隙增宽，神经细胞核固缩，嗜碱性增强，正常部位神经纤维排列致密，细胞核着色偏浅。通过4级评分法定性肠神经确定病理评分，如图3(B)所示，(1)轻微(+)：记1分，少量神经细胞水肿和变性；(2)轻度(++)：记2分，局灶性神经纤维水肿，间歇性变宽；(3)中度(+++)：记3分，神经纤维水肿，排列紊乱，细胞核结构变化和细胞形态改变；(4)严重(++++)：记4分，神经纤维结构不清楚，神经细胞数量减少，细胞核大小不同，细胞形态不规则。肥胖模型组肠神经病理评分最高，与普通饮食组相比，均有极显著差异(P<0.001)。通过益气祛痰针法干预后，与肥胖模型组相比，各电针干预组的病理评分下降，有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。

图3 各组实验小鼠空肠神经HE染色

3.5 益气祛痰针法对实验小鼠空肠神经递质含量的影响

如图4所示，空肠组织里的P物质(SP)和五羟色胺(5-HT)含量在M组中最低，和N组比较，有极显著差异(P<0.001)。益气祛痰针法干预后，和M组比较，各电针干预组的空肠SP和5-HT含量有不同程度的提高，有极显著性差异(P<0.001或P<0.01)。各益气祛痰针法干预组组间比较，仅A 28组的空肠SP含量相对A 14组比较有极显著性差异(P<0.01)。空肠组织里的血管活性P物质(VIP)含量在M组中最高，和N组比较，有极显著性差异(P<0.001)。空肠组织里的VIP含量，肥胖抵抗小鼠明显低于肥胖模型小鼠，相比较有极显著差异(P<0.001)。益气祛痰针法干预后，和M组比较，各电针干预组的空肠VIP含量随干预时间逐步降低，有极显著性差异(P<0.001和P<0.05)。

图4 各组实验小鼠空肠神经递质含量

4 讨 论

实验结果表明，益气祛痰针法在刺激关元、足三里、天枢和三阴交穴后，可提高肠胃运动功能并有可能改善ENS损害。ENS中的兴奋性和抑制性神经元协调肠道的收缩和舒张功能，提高肠道传输率，降低肥胖模型小鼠的体重和脂肪含量。ENS神经元将信号传递至兴奋性运动神经元，导致P物质和5-HT释放，引起肠道肌肉收缩。ENS神经元将信号传递至抑制性运动神经元，释放VIP，从而引起肠道肌肉松弛。营养物质长时间停留在小肠，加重ENS负担，增强小肠吸收。益气祛痰针法对关元、足三里、天枢和三阴交刺激影响了肠神经元的功能，恢复了肠道收缩肌和松弛肌之间的协调性并修复了受损的ENS，从而改善了胃肠动力。

ENS是一个大而复杂的周围神经系统，整合调控肠道内分泌、免疫、肠道菌群等，广泛控制肠道结构重塑与功能[5]。进食后，食糜引起的机械变形和肠腔化学的改变激活了相互联系的内在感觉神经元和机械敏感肠神经元网络[6]，产生的动作电位被传导至与内在感觉神经元的突触连接至中间神经元以及神经支配肌肉的兴奋性或抑制性运动神经元[7]。ENS可通过释放相应的神经递质来控制兴奋性和抑制性神经元，控制肠道平滑肌的收缩和放松，帮助肠道吸收和消化营养物质，影响机体的消化吸收，直接参与肥胖的发病。国外研究表明，饮食不均衡且热量过多参与ENS的改变，导致肥胖发生[8]。实验模型表明，长期摄入高脂饮食会导致肌肠神经元和Cajal间质细胞的功能和结构损伤，与肥胖小鼠肌间神经丛的神经病变相关，破坏神经回路，引起肠道运动障碍症状[9]。

大量研究发现，针刺治疗肥胖不仅是多途径多靶点作用，而且还直接作用于神经系统，如电针可上调肥胖大鼠抑食肽α-MSH和CART，下调促食肽NPY[10]，通过电针天枢、三阴交等穴位，能降低下丘脑TSC1启动子甲基化程度，引起体重下降[11]。天枢穴浅层分布于第9～11胸神经前支的外侧皮支和前皮支。关元通过调控下丘脑β-内啡肽与强啡肽含量而达到镇痛作用。足三里上理胃脘胀、中理腹部不适、下理小腹病痛，通过系统调节神经功能而调节胃肠动力、增进食欲、帮助消化。三阴交平衡皮质、皮质下边缘系统和小脑疼痛脑区活性，启动5-羟色胺、阿片肽等镇痛物质释放，全面调整大脑皮层的兴奋状态，缓解疼痛与紧张情绪[12]。中医学认为，肥胖的病因，多责之于脾胃功能失调形成痰湿，《黄帝内经》云:“诸湿肿满，皆属于脾”。因形体肥胖之人，多嗜膏粱厚味，酒食无度，损伤脾胃。一旦脾气虚弱，失于散布精气，则必然导致津液输布异常[13]，气虚而痰湿生。若肾气不足则无法温养脾土，致使脾失健运，水谷精微积滞，形成膏脂[14]。冯楚瞻在《冯氏锦囊秘录》曰：“虽然人但知痰之标在脾，而不知痰之本更在于肾。盖痰者水也，有肾虚不能制水，水泛为痰，是无火制痰，痰清而稀，脾、肾皆可导致痰湿为患”[15]。依据《灵枢·经脉》：“盛则泻之，虚则补之”原则，遵循《石室秘录》中“治肥人之病也。肥人多痰，乃气虚也。虚则气不能运行，故痰生之。则治痰焉可仅治痰哉，必须补其气，而后带消其痰为得耳”的方法，采用益气祛痰针法，达健脾祛痰之效，恢复阴平阳秘的状态。