38例血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型检测情况分析*

吴凡 梁爽 彭龙 苏宇清 梁延连 庄乃保

Rh血型系统是人类最复杂的血型系统。在临床输血中，Rh血型系统的重要性仅次于ABO血型系统。其中D抗原具有很强的免疫原性，是Rh血型系统中最主要的抗原。临床上根据个体是否存在RhD抗原分为RhD阳性和RhD阴性。大部分个体的RhD抗原采用直接试管法即可检出。少部分用直接试管法检测为阴性，通过间接抗人球蛋白试验才可检出，这些个体为血清学弱D表型或RhD变异型（包括弱D、一些部分D等）。我们收集38例直接试管法检测阴性，微柱凝胶卡间接抗人球蛋白法检测阳性的血清学弱D表型献血者血液样本进行RhCcEe表型与RHD基因型分析，研究深圳地区血清学弱D表型献血者RHD基因多态性。报道如下。

材料与方法

1 一般资料 筛选2019年4月～2021年2月深圳市血液中心85 862名首次献血者中直接试管法检测RhD阴性样本，血样于静脉采集5 mL，4 ℃保存于EDTA抗凝管中。

2 试剂与仪器 抗-D IgM+IgG血型定型试剂（批号：517178）为加拿大Dominion公司产品；anti-D（批号：BMI1804B）为英国Millipore公司产品；抗-D单克隆IgG抗体、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e单克隆IgM抗体血型定型试剂、抗IgG，C3d抗人球蛋白检测试剂（批号分别为：20190826、20193001、20193101、20193202、20183302、20195001）为上海血液生物公司产品；样本稀释液（ID-Diluent 2，批号：057610001）和微柱凝胶低离子抗人球蛋白卡（LISS/Coombs，批号：50531.48.17）均为美国Bio-rad 公司产品；DNA提取试剂盒（Blood DNA Purification Kit，批号：106412）为美国Promega 公司产品；人类红细胞RhD血型变异体基因分型试剂盒（批号：K202005004）为天津秀鹏公司产品。KA-2 2 0 0免疫血液学用离心机为日本KUBOTA公司产品；ID-Incubator 37 SI保温箱和ID-Centrifuge 12 SII台式离心机均为瑞士Diamed AG公司产品；MAXWELL 16 DNA提取仪为美国Promega 公司产品；ProFlex PCR System为美国Life technologies公司产品； EP-1 0 1 9电泳仪为美国Embitec公司产品；FluorChem R 多功能成像分析系统为美国ProteinSimple公司产品。

3 方法

2.2.6.3 发病条件。土壤温度和含水量是影响光叶紫花苕斑枯病2个主要的环境因素。该病的最适生长温度为25～30 ℃。春旱、秋涝，发病较严重。

4RHD基因外显子测序分析 对5例PCR-SSP法无法识别RhD变异型的样本进行RHD基因的所有外显子测序。测序结果显示，其分别为R H D*w e a kD type 95（c.730G＞C，p.Ala244 Pro）；RHD*D C C（c.6 7 7 C＞A，p.A l a 2 2 6 A s p）；R H D*DFR 1（c.5 0 5A＞C、c.5 0 9T＞G、c.5 1 4A＞T，p.Met 1 6 9Leu、p.Met 1 7 0Arg、p.Ile 1 7 2Phe）；RHD*weak D type 50（c.727T＞A，p.Tyr243 Asn）以及RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）（表2）。其中RHD*weak D type 50在中国汉族人群中首次发现。RHD*IVS9-1C为RHD基因第9内含子-1位的纯合突变（c.1228-1G＞C）尚未被ISBT（International Society of Blood Transfusion，国际输血协会）数据库收录。该等位基因的序列数据已提交GenBank，登记号为MT755965。另外RHD*weak partial 15 /RHD*DEL1杂合型经测序再次确认（图3）。5RHD杂合型分析 38例样本中37例样本可检出Rh融合盒子，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1杂合型样本未能检测出Rh融合盒子（图4，表2）。

在处理城市精明增长与蔓延发展的关系时，最重要的就是把握城市建设发展中二者的“度”，从而更好地实现城市可持续发展。下文笔者继续从城市规模角度入手，列举正确把握精明增长与蔓延发展关系的相关建议：

3.2 基因组DNA提取、PCR扩增及RHD基因检测：取300 μL全血加入Blood DNA Purification Kit DNA提取试剂盒样本槽中，采用MAXWELL 16 DNA提取仪自动化提取全血DNA。每份DNA 溶于300 μL DNA buffer。测定所提取的DNA 浓度，低于2 ng/μL的DNA不能用于以下实验。使用人类红细胞RhD基因分型试剂盒，采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）进行PCR 扩增。PCR扩增条件：96℃预变性2 min ；然后96 ℃变性20 s，68 ℃退火1 min，循环5次；96 ℃变性20s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，循环10次；96 ℃变性20 s，62 ℃退火50 s，72℃延伸45 s，循环18次；最后72 ℃延伸5 min，降温至4 ℃完成扩增。2.5%的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件分析数据。采用Kendall's tau-b相关分析，比较RhD变异型与RhCcEe表型的相关性，计算相关系数，分析探讨是否存在相关以及相关的方向。Kendall's tau-b相关系数取值范围在[-1,+1]，负值代表负相关，正值代表正相关，0则代表不存在相关关系。以P＜0.05为显著相关。

表1 RHD基因编码区扩增和测序反应引物

3.3RHD基因外显子测序及RHD杂合型分析：测定RHD基因的10个外显子序列，扩增及测序引物设计参考文献[1]，引物序列见表1。PCR反应体系为（20 μL）：DNA 1 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、高保真酶MIX 10 μL。扩增条件：95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，循环40次；最后72 ℃延伸5 min，降温至4 ℃完成扩增。引物合成和测序均由广州艾基生物技术有限公司完成，将测序结果与参比序列Genebank BN000065进行比对。特异性扩增Rh融合盒子，判断检测样本是否存在RHD基因的缺失，由天津秀鹏生物技术有限公司完成。

寄生虫侵入宿主机体后首先表现IgM上升，IgM是一种大分子抗体，相对分子质量最大，故称之为巨球蛋白，IgM能清除血流中的原虫颗粒，为一种凝集性抗体，是直接、间接凝集实验的诊断要素。张永红等[12]在小鼠腹腔接种棘球蚴原头节后，在未发育形成囊泡前30 d能测到低效价的IgM血清抗体，90 d后随着囊泡不断长大，IgM开始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗体较正常对照组降低，考虑包虫在宿主体内长期寄生，宿主的免疫抑制，导致IgM下降。

结 果

1992 年，RHD基因的cDNA被克隆[2]，随后的十几年里，从基因结构与功能方面探索RhD血型的研究进展迅速，特别是各地区人群RHD基因多态性的研究[3-7]为RHD等位基因的核苷酸序列提供了丰富的信息。根据国际输血协会（ISBT）等位基因命名表，目前已确认的RhD变异型等位基因有3 0 0多种[8]，其中我国已发现有64种[9]。RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1是我国汉族人群中主要的RhD变异型等位基因[9]。RHD*weak partial 15约占RhD变异型的22.7%[10]，其变异位置在RHD基因第6外显子、第9跨膜区（c.845G＞A，p.Gly282Asp），其突变可能影响了膜的整合，进而影响RhD蛋白和D抗原的合成表达。RHD*DVI.3是RHD基因第3～6外显子被RHCE基因相应的部分替换形成的杂交基因（RHD-RHCE(3-6)-RHD），约占RhD变异型的.7%[10]。RHD*weak partial 15和RHD*DVI.3可通过间接抗人球蛋白法检出。DEL型个体RhD抗原的表达明显下降，血清学方法一般只能通过吸收放散实验才能检出。但吸收放散实验操作繁琐、耗时长，并不作为常规检测方法，国内目前尚无明确诊断DEL型的标准，大部分实验室常常将DEL型标记为RhD阴性。中国汉族人的RhD阴性率为0.34%[11]。综合近年来相关文献，DEL型在我国汉族RhD阴性个体的比率约为30%[11-13]。中国人群两项具有大样本的综合性遗传研究显示[13-14]，95.4%（436/457）具有DEL表型的中国个体为RHD*DEL1。RHD*DEL1是RHD基因第9外显子末位1处碱基同义突变（1227G＞A，K409K），导致RNA转录后在内含子剪切时，第9内含子的识别位点“左”移至第8内含子，由此将“第8内含子+第9外显子+第9内含子”一起识别为一个“超大”内含子，“总是”被错误剪切，因此不能表达正常的RhD蛋白。随着商业化抗体试剂效价和灵敏度的提高，一些抗原表达量较高的DEL型也可用间接抗人球蛋白法检出弱阳性。本研究PCR-SSP法所采用的检测试剂盒通过中国人群常见的RhD变异型设计，可初步筛查包括RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1在内的16种RhD变异型。RHD基因的两端存在两个具有98.6%同源性的区域，即Rh盒子序列。当RHD基因全缺失时，两端Rh盒子融合为融合盒子。若样本可检出融合盒子，说明至少存在一条染色体RHD基因全缺失。本研究38例样本中，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1杂合型样本未能检测出Rh融合盒子，说明其不存在RHD基因全缺失。其余37例样本均可检出Rh融合盒子，可推测其一条染色体存在RhD变异型基因，另一条染色体为RHD基因全缺失。

2 PCR扩增及RHD基因检测（PCR-SSP法） 利用PCR-SSP方法分析RHD基因编码区，3 8例样本中15例为RHD*weak partial 15（15/38，39.5%）；1 1例为R H D*D E L 1（1 1/3 8，2 8.9%）；5例为RHD*DVI.3（5/38,13.2%）；1例为RHD*weak D type 61（1/38，2.6%）；1例为RHD*weak partial 15/ RHD*DEL1杂合（1/38，2.6%）；5例采用PCRSSP法未能确认RhD变异型（5/38,13.2%）（图1，表2）。

目前，慈王村发展散养珍珠草鸡产业的主要威胁：在冬天，茶园、农家乐处于淡季，散养鸡的销售量也有所下降，这种依赖于其他产业发展的销售模式存在被动性，扩展销路刻不容缓。

图1 RHD基因检测（PCR-SSP法）结果

3 RhD变异型与RhCcEe表型相关性分析 38个样本中PCR-SSP法共确认4种RhD变异型，其RhCcEe血型清学表型分别为RHD*weak partial 15：ccEe（1 3/1 5）、c c E E（1/1 5）、C c E e（1/1 5）；R H D*D E L 1：C C e e（8/1 1）、C c e e（3/8）；R H D*D V I.3：C c e e（4/5）、C c E e（1/5）；RHD*weak partial 15 / RHD*DEL1杂合：CcEe（1/1）；RHD*weak D type 6 1：CcEe（1/1）（表2）。经统计学处理，RHD*weak partial 15与RhCcEe抗原相关系数分别为：-0.685（P＜0.01）、0.440（P＜0.01）、0.727（P＜0.01）、-0.193（P＞0.05）；RHD*DEL1与RhCcEe抗原相关系数分别为：0.645（P＜0.01）、-0.760（P＜0.01）、-0.682（P＜0.01）、0.112（P＞0.05）；RHD*DVI.3与R h C c E e抗原相关系数分别为：0.3 6 9（P＜0.05）、0.201（P＞0.05）、-0.299（P＞0.05）、0.064（P＞0.05）。RHD*weak D type 61为个例，不参与统计分析（图2）。

图2 RhD变异型与RhCcEe表型相关性热图

3.1 RhD阴性确认及RhCcEe抗原检测：使用3种不同生产厂家的抗-D定型试剂，根据抗体性质采用直接试管法或微柱凝胶卡间接抗人球蛋白法检测RhD抗原。部分样本加做热吸收放散试验。直接试管法检测RhCcEe抗原。

图3 RHD基因外显子测序结果

图4 RHD杂合型检测结果

讨 论

1 血清学检测结果 8 5 8 6 2名首次献血者中抗-D（IgM）抗体试剂直接试管法检测阴性样本609例，其中38例样本抗-D（IgG）抗体试剂微柱凝胶卡间接抗人球蛋白法检测结果为阳性或弱阳性。可疑样本加做热吸收放散试验，结果均为强阳性。3 8例样本中RhCcEe表型结果为：ccEe（17/38）、Ccee（8/38）、CCee（8/38）、CcEe（4/38）、ccEE（1/38）。

深圳是一座“移民”城市，人口来自全国各地，本研究结果显示深圳地区血清学弱D表型献血者的RHD基因结构呈现多态性，主要为RHD*weak partial 1 5（3 9.5%）、RHD*DEL 1（2 8.9%）、RHD*DVI.3（1 3.2%），基本符合中国人群分布特征。本研究进一步证实中国人群RhD变异型的分子背景非常复杂。除了以上3种我国汉族人群主要的RhD变异型等位基因，本研究还发现RHD*weakD type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、RHD* DFR1、RHD*weak D type 50以及尚未被ISBT数据库收录的RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）等位基因各1例。上海、广州等地[10,15-16]曾有RHD*weak D type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、R H D* D F R 1的研究，均为个例报道。2 0 0 6年，Doescher等在GenBank提交RHD*weak D type 50等位基因序列数据（AM234631.1），之后各地再无相关报道。本研究的发现为后续进行该等位基因进一步的深入研究提供样本基础。本研究发现的1例新等位基因RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）与已知的RHD*01N.77（c.1228-1G＞A）等位基因的突变位置一致，但核苷酸取代不同[17]。RHD*01N.77被ISBT分类为RhD阴性，而本研究结果显示新等位基因样本与试剂3（上海血液生物公司抗-D单克隆IgG抗体）在微柱凝胶卡间接抗人球蛋白法中呈弱阳性反应，且热吸收放散试验结果呈强阳性。该位点核苷酸突变导致RhD变异型的发生机制有待我们后续进一步深入研究。

Rh血型抗原由位于1号染色体短臂1p34.3-1p36.1上2个紧密连锁高度同源的RHD基因和RHCE基因编码，其基因序列同源性高达93.8%，长度分别为57 295 bp和57 831 bp，均含有10个外显子、9个内含子。RHD基因和RHCE基因各编码417个氨基酸，2个基因紧密连锁串联排列，方向相反，3'端面对面相隔约30 000 bp[2]。RHD基因编码RhD多肽，RHCE基因编码RhCcEe多肽。1998年，WAGNER FF等研究发现DVI 3型为CDe单倍体，主要表现为Ccee表型[18]。随着研究的深入，研究人员发现78%的弱D 15型个体表现为ccEe表型[19]。DEL表型也与C抗原阳性表型具有高度相关性。一项为期6年的研究表明，在欧洲献血人群中红细胞表达C抗原的个体为DEL表型的情况明显高于其他RhD阴性人群[7]。超过83%的“亚洲型”DEL表现为Ccee表型[20]，其机制为RHCE基因中的C和/或E等位基因与RHD基因顺式串联从而进一步抑制了D蛋白的表达。本研究通过相关性分析，结果显示RHD*weak partial 15与RhE抗原（相关系数为0.727，P＜0.01）、RHD*DEL1与RhC抗原（相关系数为0.645，P＜0.01）存在显著正相关。本研究中RHD*DVI.3样本数量较少，其统计分析结果需进一步加大数据量予以确认。

热量传递可描述为能量由高温体传递至低温体的过程。与电学的欧姆定理相似，由傅里叶导热定律，传导的热量可用温度的比例关系定量描述为[7]

综上所述，本研究所获得的血清学弱D表型献血者的RHD基因结构频率可以粗略反映其在中国人群中的分布。由于RHD*weak partial 15与RhE抗原、RHD*DEL1与RhC抗原的相关性，RhC抗原和RhE抗原的血清学检测可以有效筛选我国主要的RhD变异型，为后续进一步研究提供理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突