高原低氧快速适应人群筛选及其低氧适应相关基因的表达研究*

李翠莹 李小薇 肖军 雷慧芬 孟方园 高瞻

高原具有低压缺氧（其氧浓度仅为海平面的60%）、寒冷干燥等不利因素，会引起急进高原的平原人员发生一系列生理或病理改变，主要表现在血红蛋白代偿性升高、血氧饱和度降低等，约75.7%的人群会出现轻中度高原反应，严重者可导致肺水肿、脑水肿等疾病[1-2]。有研究提出在高原条件下，藏、汉族人群创伤休克时因失血、缺氧等因素导致其输血策略不同：急进高原人员输血量是高原移居者的1.5倍，是高原藏族的2倍[3]。可见，高原条件的输血策略具有与平原地区不同的特点。合理、有效的输入血液成分及筛选高携氧能力的红细胞输注是高原输血治疗的关键。

目前已知，血红蛋白（hemoglobin，Hb）具有结合、贮存、运输和释放氧的能力，但其结构和功能的研究仍然是高原低氧医学的重点。近年来多项研究发现，藏族基因突变频率高于汉族，藏族血红蛋白氧亲和力高于汉族，动脉血氧饱和度接近平原地区，是长期自然选择和进化的结果，存在遗传学因素的作用[4]。遗传基因与低氧适应密切相关，其中以低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）相关基因EPAS1、EGLN1和PPARA为主，其在遗传水平影响着高原低氧环境的适应性[5]。那么汉族是否存在快速适应高原的优势基因型人群？平原汉族进入高原后红细胞（red blood cell，RBC）及血红蛋白变化规律等问题还有待进一步研究。

本文针对平原汉族人群进入高原后低氧习服适应的变化规律及发生机制进行研究，在藏、汉族人群高原适应的差异研究基础上，筛查高原低氧诱导因子相关基因及高氧亲和力血红蛋白F（HbF）分型的人群，选择高表达低氧适应相关基因及其高携氧能力的红细胞，筛选高原低氧快速适应人群。

对象与方法

1 研究对象 采集平原汉族（海拔50～500米）、进驻高原（海拔2 500～3 000米、3 700～4 600米）3天、7天、30天、90天、久居高原（＞10年）汉族及世居高原藏族血液样本742份，进行藏、汉族人群高原适应的差异研究。所有受试者均签署知情同意书，并通过个人调查，排除相互之间的血缘关系。该项目通过伦理审批，审批号：空总（科研）第2017-16-YJ01。

2 研究方法

2.1 血常规及血氧饱和度检测：根据世居平原汉族（海拔50～500米）、急进高原3天（海拔2 500～3 000米）和7天汉族（海拔3 700～4 600米）、高原低氧习服训练30天汉族（海拔3 700米）、高原低氧习服训练90天汉族（海拔3 700米）、世居高原藏族（海拔3 700米）及久居高原汉族（海拔3 700米居住＞10年）进行分组，采用全自动血细胞分析仪和血氧饱和度检测仪测定不同分组血液样本的血常规及血氧饱和度SpO2数据。

2.2EPAS1、EGLN1和PPARA基因mRNA表达水平检测：对上述分组人群的血液样本提取总RNA，并反转录为cDNA；设计3个基因的实时定量PCR引物，SYBR Green法检测3个基因mRNA表达量，明确不同分组人群中高原低氧适应相关基因mRNA表达水平的差异。

2.3 高氧亲和力HbF分析：根据上述分组，平原汉族、久居高原汉族及世居高原藏族中每组20例，采用蛋白电泳方法分析高氧亲和力HbF差异，操作步骤参照试剂盒说明书。

3 统计学处理 采用SPSS 26.0进行不同分组人群血常规及SPO2的差异分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布进行独立样本t检验；多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用Dunnett't分析；重复测量资料采用重复测量方差分析，多重比较采用Bonferroni方法进行校正；不符合正态分布采用非参数Mann-Whitney U检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同分组人群中生理指标的检测结果 与平原汉族男性对比，急进高原3天、7天、高原习服训练30天、90天及久居高原汉族血红蛋白浓度显著升高，世居高原藏族Hb浓度略有升高（表1、表2）；平原汉族进入高原后血氧饱和度（SpO2）显著降低，世居高原藏族SpO2与平原汉族比较略有降低（图1）。

2 其他血液指标变化 ①红细胞与红细胞压积（Hct）：与平原汉族男性比较，进入高原后（3天、7天、30天、90天）、久居高原汉族及藏族均显著升高；②白细胞（white blood cell，WBC）：平原汉族男性进入高原后升高，藏族及久居高原汉族男性高于平原汉族；③血小板（platelet，PLT）：平原汉族男性进入高原后升高，藏族男性明显高于平原汉族和久居高原汉族（表1、表2）。

表2 同一组人员进入高原前后血常规各参数统计学分析（ ±s）

3 血液SpO2结果 与平原汉族SpO2（9 4～9 9%，97.28±1.46%）对比，急进高原3天SpO2（79～93%，8 7.6±3.1%）显著降低，高原习服3 0天SpO2（85～95%，90.4±2.6%）有所升高，但仍低于平原汉族；久居高原组SpO2（80～95%，87.7±5.6%）与急进高原3天数据接近，藏族SpO2（89～100%，94.5±2.5%）仍低于平原，但高于其他分组（图1）。

图1 不同分组人群中血氧饱和度SpO2的差异

4 高原低氧适应相关基因EPAS1、EGLN1及PPARA的mRNA表达水平检测结果 平原汉族进入高原3天及7天EPAS1基因表达升高，激活下游EPO等靶基因转录，增加机体血红蛋白含量；EGLN1和PPARA基因急进高原3天时表达显著降低，减少对EPAS1基因表达的抑制，促进其下游靶基因转录，高原习服训练30天3个基因表达水平达到平衡；高原习服90天及久居高原汉族3个基因的表达水平均显著高于世居平原汉族，世居高原藏族EPAS1及PPARAmRNA表达水平高于世居平原汉族，与其血红蛋白含量高于平原汉族结果相一致（图2）。同时，分析了平原汉族进入高原3天EPAS1基因表达升高与未升高人员的高原前后血常规参数变化情况，EPAS1基因表达未升高人员进入高原后RBC、Hb及Hct变化明显高于升高人员（表3）。

图2 不同分组人群中EPAS1、EGLN1及PPARA基因表达水平

表3 EPAS1基因表达明显变化人员高原前后血常规各参数差值的统计学分析（ ±s）

5 不同分组人群中高氧亲和力HbF分析 蛋白电泳检测高氧亲和力H b F差异：正常成人血红蛋白HbA≥96.5%，HbF＜2.0%，HbA2≤3.5%，而婴儿血红蛋白HbF 60%～93%，HbA2＜1%，其中HbF具有更高的氧亲和力。对不同分组人群中血红蛋白进行电泳发现，世居高原藏族人群中54.5% HbF电泳阳性，久居高原汉族人群中27.3% HbF电泳阳性，平原汉族人群中仅有14.3% HbF电泳阳性（图3）。

图3 高原低氧环境下不同分组中血红蛋白分型的差异

讨 论

高原低氧环境下创伤失血性休克是高原医学救治的难点，主要存在两方面问题，一方面是救治困难、死亡率高，因高原低压缺氧等特殊环境导致机体失血耐受能力低、液体耐受能力小、多器官衰竭发生早，救治效果差，死亡率显著高于平原[2]；另一方面是高原输血策略与平原地区不同，平原汉族急进高原失血性休克的输血量是藏族的2倍，大量输血导致血流减缓，加重组织缺氧，不利于救治[3]。因此，合理、有效的输入高携氧能力血液成分是高原输血治疗的关键。

近年来国际顶尖杂志Science、Nature、Cell等发表的多篇文章表明，关于藏汉族高原耐缺氧机制的研究多集中在低氧诱导因子相关基因以及红细胞携释氧功能研究等[6-8]。通过本研究，明确了进入高原后红细胞及血红蛋白的变化规律。项目组研究发现高原低氧对机体血液参数产生较大影响，甚至影响机体免疫功能。平原汉族进入高原后机体通过增加RBC及Hb水平以满足各个组织器官的氧供，而这种变化也增加了血液粘度，伴随着PLT计数升高，可能增加血栓形成的风险；而且在高原低氧条件下，WBC亦升高，提示机体免疫功能也可能出现紊乱。针对前述问题，则需筛选快速适应高原的平原人群，并对其进行低氧习服训练，以更快适应极端的低氧环境，而不出现严重的高原反应[9]。因此，本项目前期在平原汉族男性中筛选出EPAS1基因rs13419896和rs1868092位 点A-A优 势 单 体 型，EGLN 1基 因rs 1 2 0 9 7 9 0 1和rs2790859位点G-C优势单体型，携带上述高原优势单体型的人群可快速习服适应高原[10-11]。

关于低氧诱导因子相关3个基因mRNA表达水平研究发现平原汉族急进高原后EPAS1基因表达水平显著升高，EGLN1基因、PPARA基因表达具有相应的变化规律。分析原因：①EPAS1编码低氧诱导因子HIF-2α，作为低氧诱导因子的主要成分之一，高原低氧环境刺激其表达升高是高原习服的表现，其可激活下游EPO等靶基因转录，增加RBC计数及Hb含量适应高原。因此我们认为进入高原后EPAS1基因表达量高于平原的人群利于机体红细胞生成，使高原低氧机体红细胞造血达到平衡，避免过多的红细胞产生，可快速习服高原的适应人群。②EPAS1及PPARA负调控HIF-2α，平原进入高原3天表达下调，进而减少对HIF-2α表达的抑制，促进HIF下游EPO等靶基因的表达，促进红细胞生成及成熟，利于高原习服适应。本研究分析发现平原汉族急进高原3天EPAS1基因表达未升高人员进入高原后RBC、Hb及Hct变化明显高于基因表达升高人员，提示EPAS1基因表达未升高人员进入高原后可能存在血液粘度显著升高，不利于高原低氧习服。因此，筛选进入高原3天EPAS1基因表达升高人员可利于平原汉族的高原低氧习服适应。

项目组通过蛋白电泳检测发现，世居高原藏族高氧亲和力血红蛋白分型HbF含量最高，其次是久居高原汉族，平原汉族中最少。藏族人群血液中高氧亲和力HbF含量高，说明其动脉血氧饱和度相对较高，这与藏族SPO2高于急进高原组和高原习服组结果一致（图1）。而本研究中久居高原组HbF比例比平原汉族多，但是高原地区久居高原组SPO2却低于高原习服组，分析原因可能是该组人员数量较少。这与项目组前期平原汉族、急进高原、高于习服、久居高原汉族及高原藏族人群的红细胞携释氧功能P50[12-13]及拉曼光谱测定血红蛋白结构的研究结果一致[14-15]。因此，世居平原汉族急进高原初期主要通过RBC计数、Hb含量增加及RBC释放氧功能增加保证机体供氧；随着进驻高原时间的延长，RBC与氧的亲和力逐渐增加产生高原习服；世居高原藏族RBC计数及Hb含量略高于平原，其对高原适应主要源于红细胞与氧的亲和力强，满足机体各个组织及器官供氧。

综上所述，本研究对世居高原藏族、世居平原汉族、急进高原3天及7天、高原习服30天及90天、久居高原汉族人群分组，开展高原适应人群的筛选研究，筛选出进入高原EPAS1基因表达升高的人群，具有高携氧能力红细胞HbF的人群，为高原低氧适应人群的选拔提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突