前列腺癌组织中Foxp3+调节性T细胞增高并与淋巴管和微血管密度呈正相关

刘维辉，张河淦，范大铬，何清柳，黄庭芳*，颜醒愚

（1福建医科大学附属第二医院泌尿外科, 2福建省泉州市妇幼保健院·儿童医院妇科，3福建医科大学附属第二医院病理科，泉州 362000）

前列腺癌特指发生于前列腺的上皮性恶性肿瘤，腺癌是前列腺癌主要病理类型，约占95%以上。2015年，我国全国前列腺癌发病率为10.23/10万，死亡率为4.36/10万，近年来其发病率呈现持续快速增长趋势，好发于70~80岁的老年人[1,2]。前列腺癌不仅可以通过淋巴管、血管转移，且癌组织中淋巴管和微血管密度是决定患者预后的重要因素[3]。淋巴细胞亚群调节性T细胞对机体的免疫反应具有负调节作用，参与肿瘤细胞的免疫逃逸[4-6]，在维持自身耐受和避免免疫反应过大而造成器官功能损伤中具有重要作用。本研究旨在探讨Foxp3+调节性T细胞在前列腺癌中的表达情况，分析其与前列腺癌组织中淋巴管、微血管密度的相关性，为前列腺癌的临床诊治及预后提供参考。

资料与方法

1 一般资料

自2015年1月1日至2020年11月30日，收集我院收治的前列腺癌患者100例作为观察组，同期收集前列腺增生患者100例作为对照组。观察组纳入标准：①确诊前列腺腺癌；②年龄51~82岁；③行手术治疗，可获得组织病理标本；④同意参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①转移性前列腺癌；②合并其他恶性肿瘤；③感染；④1月内曾使用免疫调节剂；⑤肝肾功能不全；⑥严重心脑肺功能不全；⑦泌尿生殖系统结核；⑧其他严重病变。对照组纳入标准：①确诊良性前列腺增生；②年龄55~85岁；③行手术治疗，可获得组织病理标本；④同意参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①转移性前列腺癌；②合并其他恶性肿瘤；③感染；④1月内曾使用免疫调节剂；⑤肝肾功能不全；⑥严重心脑肺功能不全；⑦泌尿生殖系统结核；⑧其他严重病变。两组年龄和合并症等一般资料比较差异无统计学意义（表1）。

表1 前列腺腺癌和前列腺增生患者一般资料比较Tab. 1 Comparison of general data between prostate cancer group and prostate hyperplasia group

2 主要试剂和设备

主要试剂：抗Foxp3抗体、抗Foxp3同型对照抗体、抗CD25抗体、抗CD25同型对照抗体、抗CD4抗体、染色缓冲液，固定液/穿膜剂浓缩液 （BD Bioscience公司，美国），鼠抗人CD34抗体（稀释度1:50）、鼠抗人D2-40抗体（稀释度1:50），酶标抗小鼠IgG聚合物、反应增强液、DAB显色剂、柠檬酸盐组织抗原修复液、磷酸盐缓冲液PBS、苏木素试剂（福州迈新生物技术开发有限公司），人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA）ELISA检测试剂盒（内含微孔酶标板、标准品、样本稀释液、检测抗体-HRP、洗涤缓冲液、底物A与B、终止液、封板膜）（上海将来实业股份有限公司）。

主要设备：Epics XL型流式细胞仪（Beckman coulter公司，美国）；离心机：Centrifuge 5424/5424R型号高速离心机（艾本德Eppendorf，德国）；显微镜：CX43型号显微镜（奥林巴斯，日本）；淋巴细胞分离液（上海哈灵生物科技有限公司，中国）；博科全自动酶联免疫检测仪BIOBASE8001（山东博科再生医学有限公司，中国）。

3 Foxp3+调节性T细胞流式细胞术分析

取前列腺癌组织、癌旁组织、前列腺增生组织制作成细胞悬液，调整细胞浓度，分别置入相应的流式管进行表面标记：于各管中分别加入CD4、CD25抗体及同型对照（其中空白管不加任何抗体，CD25同型对照管加抗CD4抗体和抗CD25同型对照抗体，CD4CD25、Foxp3同型对照及CD4CD25Foxp3管加抗CD4抗体和抗CD25抗体），混匀，4℃避光孵育30min。加入染色缓冲液，利用密度梯度离心法，取得相应组织中的细胞悬液，Foxp3同型对照、CD4CD25Foxp3管中分别加入Foxp3同型对照抗体或抗体，再次离心洗涤后悬浮于染色缓冲液，上流式细胞仪检测，利用FSC/SSC参数先找到淋巴细胞群，以CD4+CD25+双阳细胞设门，以Foxp3同型对照确定其阳性信号，分析Foxp3+调节性T细胞百分比。

4 淋巴管和微血管密度分析

EnVision法免疫组织化学染色标记淋巴管和微血管：取前列腺癌组织、癌旁组织、前列腺增生组织标本用10%福尔马林固定，石蜡包埋，65℃烤片1h，常规脱蜡水化，微波法柠檬酸盐组织抗原修复液进行抗原修复，自然冷却至室温，PBS洗，封闭30min；入鼠抗人CD34抗体（稀释度1:50）或鼠抗人D2-40抗体（稀释度1:50），室温下孵育1h；PBS冲洗后，加入反应增强液，室温下孵育20min，PBS冲洗后再加入酶标抗小鼠IgG聚合物，室温下孵育30min；PBS冲洗后，显微镜下DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染后水洗，脱水、透明、封片。

微血管、淋巴管密度计数：参照Weidner计数方法，以内皮细胞着色呈棕黄色为阳性，其中抗CD34染色阳性者为微血管，D2-40抗体染色阳性者为淋巴管。先在10×物镜下找到CD34阳性微血管和D2-40阳性淋巴管密集的“热点”区域，再在20×物镜下选择4个视野，由两名病理科经验丰富的医师采取双盲法计数CD34阳性微血管和D2-40阳性淋巴管，取平均值。

5 前列腺癌组织的Gleason评分

根据前列腺癌组织腺体的分化程度，由两名病理科经验丰富的医师对前列腺癌组织进行Gleason 5级评分：第1级1分，分化好，每递升1级增加1分，第5级5分，为未分化。对于同一肿瘤不同区域腺癌结构的变异，按其主要和次要分化程度分别评分，以该两项评分相加的总分作为判断预后的标准，相加后的Gleason评分积分为2、3、4分者相当于高分化腺癌，5、6、7分者相当于中分化腺癌，8、9、10分者相当于低/未分化癌。

6 前列腺癌患者血清前列腺特异性抗原浓度ELISA检测

清晨采集空腹患者静脉血2ml，室温放置2h后于1000g离心20min，取上清，通过人PSA检测试剂盒采用ELISA法检测：取微孔酶标板设置标准品孔和样本孔，分别加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，封板膜封住反应孔，恒温箱温育60min，洗涤缓冲液洗板5次，再分别加入底物A、B，37℃避光孵育15min，最后加入终止液，15min内应用全自动酶联免疫检测仪测定450nm波长OD值，计算PSA浓度。

7 统计学分析

所有研究数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料采用的形式表达，计数资料采用n（%）表示。3组间计量资料差异采用方差分析，两两比较采用独立样本t检验分析，计量资料之间的线性相关性采用Pearson线性相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Foxp3+调节性T细胞在前列腺癌组织中高表达

对前列腺癌组织、前列腺增生组织和癌旁组织（各22例）进行流式细胞术检测显示：前列腺癌组织中Foxp3+调节性T细胞占9.22±1.61%，显著高于前列腺增生组织的7.45±1.38%和癌旁组织的8.12±1.51%（P<0.05）（图 1）。

图1 癌旁组织（A）、前列腺增生（B）和前列腺癌（C）中Foxp3+调节性T细胞比例的流式细胞仪检测Fig. 1 Flow cytometry analysis of the proportion of Foxp3+regulatory T cells in para-carcinoma (A) tissues, prostate hyperplasia (B) and prostate cancer(C)

2 前列腺癌组织中淋巴管和微血管密度增加

对前列腺癌组织、前列腺增生组织和癌旁组织进行淋巴管和微血管免疫组织化学染色后，对内皮细胞D2-40染色阳性的淋巴管密度和CD34染色阳性的微血管密度检测显示：前列腺癌组织中淋巴管密度为5.76±3.02，显著高于前列腺增生组织中的2.32±1.45和癌旁组织中的3.64±1.54；前列腺癌组织中的微血管密度为42.21±10.15，显著高于前列腺增生组织中的21.87±8.25和癌旁组织中的30.92±9.64（图2，表2）。

图2 CD34和D2-40表达的免疫组织化学检测分析前列腺癌组织和癌旁组织中微血管和淋巴管密度。前列腺癌组织中CD34阳性的微血管（A）和D2-40阳性的淋巴管（B）密度较癌旁组织中CD34阳性的微血管（C）和D2-40阳性的淋巴管（D）密度显著增高；比例尺，A，50μm; B，C，D，100μmFig. 2 Analysis of the densities of microvessels and lymphatic vessels in prostate cancer and adjacent tissues by immunohistochemical detection of the expression of CD34 and D2-40. The densities of CD34 positive microvessels (A) and D2-40 positive lymphatics (B) in prostate cancer were significantly higher than those of CD34 positive microvessels (C) and D2-40 positive lymphatics (D) in adjacent tissues. Scale bar, 50μm in A and 100μm in B to D

表2 前列腺癌组织、前列腺增生组织和癌旁组织中淋巴管、微血管密度比较Tab.2 Comparison of lymphatic vessel and microvessel densities in prostate cancer tissues, prostatic hyperplasia tissues and para-carcinoma tissues

3 前列腺癌组织中Foxp3+调节性T细胞百分比与淋巴管和微血管密度正相关

将前列腺癌组织中Fox3+调节性T细胞百分比与淋巴管密度和微血管密度分别进行线性相关分析显示：Fox3+调节性T细胞百分比与淋巴管密度和微血管密度均呈正相关（表3）。

表3 前列腺癌组织中Fox3+调节性T细胞百分比与淋巴管、微血管密度的相关性Tab.3 Correlation between Fox3+ regulatory T cells percentage and lymphatic vessel and microvessel density in prostate cancer tissues

4 前列腺癌组织的Gleason评分与Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度正相关

根据前列腺癌组织腺体分化程度进行评分显示，前列腺癌组织的Gleason评分为7.37±1.02。将Gleason评分与Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度进行线性相关性分析，结果显示：Gleason评分与前列腺癌组织中调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度均呈正相关（表4）。

表4 前列腺癌组织Gleason评分与Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度的相关性Tab.4 Correlation between Gleason score and Fox3+ regulatory T cells percentage, lymphatic vessels and microvessel density in prostate cancer tissues

5 前列腺癌患者血清中前列腺特异性抗原浓度与前列腺癌组织中Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度的相关性

收集前列腺癌患者通过全自动生化检测仪测定的血清中前列腺特异性抗原PSA浓度，结果显示PSA浓度为17.717±8.65ng/ml。将PSA浓度与前列腺癌组织中调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度进行线性相关性分析，结果显示：PSA浓度与前列腺癌组织中Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度均呈正相关（表5）。

表5 前列腺癌患者血清中前列腺特异性抗原PSA浓度与前列腺癌组织中Fox3+调节性T细胞百分比、淋巴管及微血管密度的相关性Tab.5 Correlation between prostate specific antigen concentration of prostate cancer patients and Fox3+ regulatory T cells percentage, lymphatic vessels and microvessel density in prostate cancer tissues

讨 论

免疫在多种癌症中发挥了重要作用[7]。调节性T细胞是一种免疫负调节细胞，对维持机体的免疫耐受具有重要意义。调节性T细胞于胸腺产生后输出至外周，调控反应性T细胞的活化与增殖。但在肿瘤患者中，调节性T细胞增高，并通过抑制细胞毒性T细胞等的产生，从而导致肿瘤细胞对机体的免疫耐受[8]。

1995年Sakaguchi第一次报道了调节性T细胞[9]，其参与了感染、心血管疾病、免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的发生和发展过程。目前调节性T细胞与肿瘤免疫是学者关注的重点领域[10]。肿瘤患者中，调节性T细胞可以通过免疫抑制、免疫无功能作用，抑制机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用，帮助肿瘤细胞免疫逃逸，导致肿瘤快速生长和转移。调节性T细胞可分为多个亚群，以CD4+CD25+为代表的Th1型细胞、Th3型细胞为主，外周血约2%~10%CD4+T细胞为CD4+CD25+调节性T细胞[11]。有研究指出，由于CD25既是调节性T细胞的特异性标志，又是细胞活化的标志，因此不能以CD25+作为调节性T细胞的代表，应以CD4+CD25高表达作为调节性T细胞的代表[12]。另有研究发现，CD4+调节性T细胞根据CD25表达程度，将调节性T细胞分为CD4+CD25阴性、CD4+CD25低表达、CD4+CD25高表达三种类型，但大部分CD4+CD25低表达及几乎所有CD4+CD25高表达调节性T细胞中均发现Foxp3表达，由此指出应以CD4+CD25+Foxp3+作为调节性T细胞的特异性代表[13]。调节性T细胞分化及维持生理功能的过程中，转录因子Foxp3可发挥重要功能，并可在调节性T细胞中特异性表达，Foxp3已成为检测调节性T细胞的一种特异性标志。

目前，已有研究探讨了调节性T细胞在前列腺癌发生及进展中的作用。研究显示诱导调节性T细胞凋亡，可以促进前列腺癌患者免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用[14]。前列腺癌组织中调节性T细胞表达增加，与前列腺癌的进展相关，且正常前列腺组织中调节性T细胞水平与Gleason评分亦存在正相关性[15]。前列腺癌组织中微血管密度、淋巴管密度增高，是前列腺癌细胞生长、浸润、转移及复发的必要条件。微血管密度、淋巴管密度可以直接反映癌组织中新生微淋巴管和微血管的活跃程度[16]。本研究显示前列腺癌组织中Foxp3+调节性T细胞表达水平增高，与微血管密度、淋巴管密度正相关，提示Foxp3+调节性T细胞可能参与了前列腺癌细胞的生长和转移过程，与患者预后不良有关。Gleason评分是一种被广泛采用的前列腺癌组织学分级方法[17,18]，与前列腺癌生物学行为和预后关联良好，Gleason评分成为了制定前列腺癌治疗方案的重要参考指标[19,20]。Gleason评分越高，患者预后越差[21]。本研究显示Gleason评分越高的前列腺癌患者，其癌组织中Foxp3+调节性T细胞的表达水平也越高，且淋巴管和微血管密度也越大，具有显著正相关性。PSA是由前列腺上皮细胞合成分泌，广泛应用于前列腺癌的诊断与治疗后随访监测，与患者预后密切相关[22-24]。本研究显示前列腺癌患者血清PSA含量水平越高的患者，癌组织中Foxp3+调节性T细胞表达越高，淋巴管和微血管密度也越大，呈现显著正相关性。结合Gleason评分和PSA与Foxp3+调节性T细胞表达水平的相关性分析，我们推测前列腺癌组织中Foxp3+调节性T细胞表达水平增高与患者预后不良有关，Foxp3+调节性T细胞有望成为前列腺癌诊断与预后判断的标志物。

综上所述，Foxp3+调节性T细胞在前列腺癌组织中高表达，与淋巴管、微血管密度正相关，且与前列腺癌患者Gleason评分和PSA水平正相关，可用来预测前列腺癌患者的预后。