转录因子STAT5A、STAT5B在T淋巴母细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

宋鹤，步鹏，杜海艳，赵国海，张红玲，王雅婧，张飞，郗彦凤*

（1山西医科大学病理教研室，太原030001；2山西省肿瘤医院病理科，太原 030013）

T淋巴母细胞淋巴瘤（T-LBL）是血液系统罕见的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，其临床进展迅速且预后较差，传统治疗方案疗效不显著，复发和转移率均较高[1]。同时由于该疾病较为罕见，临床资料和研究材料均具有一定的局限性，有关T-LBL的分子遗传学及有效分子靶向治疗的资料较为少见。因此，应积极寻找与T-LBL的肿瘤形成和发展相关的理论机制，以提供有效的治疗和预防方法。STATs（信号转导和转录激活因子）蛋白是参与细胞增殖、分化、凋亡和造血等基本生物学功能的转录因子，截至目前，在哺乳动物中共发现七种STAT，依次命名为STAT1~STAT6，其中STAT5包括STAT5A和STAT5B[1]。STAT5A和STAT5B是一种广泛表达的蛋白，是JAK/STAT信号通路的一部分，具有参与造血调节和免疫系统调控等功能。研究表明，在不同的血液系统疾病中，均可发现STAT5A、STAT5B蛋白表达的失调，这被认为是导致疾病发生发展的原因，因此，STAT5A和STAT5B也成为了当今血液系统疾病药物研究的重点[2]。本研究旨在明确STAT5A、STAT5B在T-LBL中的表达情况及预后相关性，着重分析STAT5A及STAT5B之间的临床病理特征关系，为T-LBL的临床诊断及药物靶向治疗提供潜在的理论参考。

资料与方法

1 病例资料

收集整理2001年1月至2020年10月山西省肿瘤医院被明确诊断为T-LBL的新发病例，从中选取出术前未接受放化疗且有完整的病程记录者共104例，其中男性82例，女性22例；年龄分布在2~75岁，中位年龄为31岁；原发于淋巴结内98例，原发于淋巴结外6例。另选取40例淋巴结反应性增生（LH）组织作为对照。患者随访时间截止为2020年9月。本研究所用标本均已取得山西省肿瘤医院伦理委员会许可。

2 制作组织芯片

用标准石蜡组织芯片制作仪制备孔径为2.0mm的空白组织芯片。选取T-LBL和LH的石蜡组织标本，使用直径为2.0mm的金属空心穿刺针在目标石蜡组织上穿刺提取组织，并将提取的组织填入组织芯片的相应位置。后将制作完成的石蜡组织芯片置于55℃的烤箱中7min，取出室温下冷却7min，重复此步骤，直至目标石蜡组织与空白组织芯片充分融合。将制备的组织芯片进行3μm的连续切片，切下的组织置于载玻片之上，放于65℃烤箱中烘烤50min后备用。

3 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色由罗氏公司BenchMarkXT全自动免疫组织化学仪检测完成。小鼠抗STAT5A、STAT5B单克隆抗体均购自ThermoFisher Scientific公司，分别按照1:3000和1:3200的稀释比进行稀释，配备抗体工作液。选正常人体脾组织为STAT5A阳性对照，正常人体肺组织为STAT5B阳性对照。

4 结果判读

STAT5A和STAT5B阳性免疫反应产物定位于细胞核。根据免疫组织化学评分法（IRS），STAT5A和STAT5B的染色结果判读为阳性细胞比例评分和染色强度评分的乘积。阳性细胞比例评分：无阳性细胞（0分），≤10%阳性细胞（1分），10%-50%阳性细胞（2分），51%-80%阳性细胞（3分），≥80%阳性细胞（4分）。染色强度评分：无染色（0分），淡黄染色（1分），棕黄染色（2分），棕褐染色（3分）。两项乘积所得分数即为总分数，总分≥2即判定为阳性，具体评分细则：0~1分（-）、2~3分（+）、4~8分（++）、9~12分（+++）[3]。所有免疫组织化学染色结果由两名病理科中级及以上职称的医师采取双盲法进行判读。

5 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。比较各组间计数资料采用χ2检验，比较各个变量之间的相关性分析使用Spearman相关性分析，生存及预后分析采用Kaplan-Meier法进行，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 STAT5A在T-LBL中的表达及其与临床病理的关系

在104例T-LBL临床病例中，STAT5A阳性率为69%（72/104），其中9例呈弱阳性（+），51例呈阳性（++），12例呈强阳性（+++）。在对照组40例LH标本中，STAT5A主要呈弱阳性或阴性，阳性率为5%（2/40），显著低于T-LBL临床病例组织（χ²= 12.462，P=0.020）（图 1，表 1）。

图1 STAT5A在T-LBL及LH组织中表达的EnVision法免疫组织化学检测。A，STAT5A在LH组织中低表达/不表达； B，STAT5A在T-LBL组织中呈弱阳性；C，STAT5A在T-LBL组织中呈中等阳性； D，STAT5A在T-LBL组织中呈强阳性；比例尺20μmFig. 1 Immunohistochemical examination for the expression of STAT5A in T-LBLand LH tissues. A, low expression or no expression of STAT5A in LH tissues; B, weak expression of STAT5A in T-LBL tissues; C, moderate expression of STAT5A in T-LBL tissues; D, strong expression of STAT5A in T-LBL tissues; scale bar, 20μm

STAT5A的表达与患者的性别有关（P=0.014，表1），男性患者的阳性表达率显著高于女性患者，而与患者的年龄、国际预后指数（IPI）评分、血清乳酸脱氢酶（LDH）水平、Ann Arbor分期、纵膈是否增宽、是否累犯骨髓、有无B症状等均无关（表1）。纵膈的宽度与患者的年龄、体型以及呼吸相等相关，不同的病人其纵膈宽度不同。根据山西省肿瘤医院影像科CT结果显示，本实验中所涉及104例T-LBL病例中，纵膈增宽者为58例，检查未见纵膈明显增宽者为46例。

截止2020年6月底，104例T-LBL患者中，已死亡病例79例，生存病例25例，STAT5A高表达者总生存期低于低表达者（P=0.027)（图2）。

图2 STAT5A表达水平与T-LBL患者预后关系的 Kaplan-Meier 生存曲线分析Fig. 2 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between STAT5A expression level and the prognosis of T-LBL patients

2 STAT5B在T-LBL中的表达及其与临床病理的关系

STAT5B在T-LBL中呈强阳性表达，阳性表达率为71%（74/104），其中62例呈强阳性（+++），7例呈阳性（++），5例呈弱阳性（+）。40例LH中，生发中心呈弱阳性表达，总阳性表达率为22.5%（9/40）。STAT5B在T-LBL中的阳性表达率显著低于其在LH中的阳性表达率（χ²=10.753，P=0.043)（表1，图3）。

图3 STAT5B在T-LBL及LH组织中表达的EnVision法免疫组织化学检测。A，STAT5B在LH生发中心低表达； B，STAT5B在T-LBL组织中呈弱阳性；C，STAT5B在T-LBL组织中呈中等阳性； D，STAT5B在T-LBL组织中呈弥漫性强阳性；比例尺20μmFig. 3 Immunohistochemical examination for the expression of STAT5B in T-LBL and LH tissues. A, low expression of STAT5B in LH tissues; B, weak expression of STAT5B in T-LBL tissues; C, moderate expression of STAT5A in T-LBL tissues; D, diffuse and strong expression of STAT5B in T-LBL tissues; scale bar, 20μm

STAT5B的表达水平与患者年龄呈负相关（P=0.038），而与患者有无B症状（B症状：1、不明原因高热，体温通常≥38℃；2、体重下降，6个月内体重减少超过总体重的10%；3、盗汗）呈正相关（P=0.036），与患者的性别、IPI评分、Ann Arbor分期、纵膈是否增宽、是否累犯骨髓等无关（表1）。在104例T-LBL中，STAT5B高表达患者的总生存期低于低表达者（P=0.037）（图4）。

图4 STAT5B表达水平与T-LBL患者预后关系的 Kaplan-Meier 生存曲线分析Fig. 4 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between STAT5B expression level and the prognosis of T-LBL patients

3 T-LBL患者中STAT5A和STAT5B共表达者与各临床病理参数之间的关系

在104例T-LBL中，STAT5A、STAT5B均阳性者53例，将其分为一组，其他表达者共51例，分为另一组，与各临床病理参数的关系分析显示，STAT5A+/STAT5B+组与患者Ann Arbor分期呈正相关，与患者性别、年龄、IPI评分、LDH活性、是否纵膈增宽、是否累犯骨髓等均无明显相关性。STAT5A+/STAT5B+组患者总生存期低于其他组患者（表1，图5）

图5 STAT5A与STAT5B共表达与T-LBL患者预后关系的 Kaplan-Meier 生存曲线分析Fig.5 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship between the co-expression of STAT5A and STAT5B and the prognosis of T-LBL patients

表1 T-LBL组织中STAT5A和STAT5B的免疫组织化学表达与临床病理参数之间的关系Tab. 1 The expression of STAT5A and STAT5B in T-LBL tissues and their correlation with the clinicopathological factors

讨 论

T-LBL是一种罕见的具有高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，由不成熟的前体T淋巴细胞转变生成，多见于儿童及青少年，男性患者多于女性，早期局限于淋巴组织，晚期可累犯骨髓[4]。目前，临床上治疗T-LBL仍以化疗为主，但由于其复发率较高（40%~60%），此类疾病的总生存率（OS）仍旧较低[5]，因此寻找新的治疗方法及预后指标尤为重要。

STAT5是一种广泛表达的蛋白质，参与干扰素和生长激素等细胞因子激活的信号转导通路，其包括STAT5A和STAT5B两种蛋白，二者具有94%的结构同源性，但从不同的基因转录而来[6]。STAT5可通过转录改变或蛋白质-蛋白质相互作用，诱导抗凋亡信号转导，提供其致癌活性。多项研究表明，各类癌症如肺癌、胃癌、乳腺癌等，呈STAT5高表达。Moriggle等[7]的研究显示，在造血谱系中，单独的STAT5激活即可导致骨髓细胞的恶性转化。而Li等人[8]的研究证实，在骨髓瘤和淋巴瘤中，激活的STAT5与TEL/JAK2癌基因的关联可导致癌症的发生。STAT5A和STAT5B也分别被认为是慢性髓系白血病的发生、发展以及急性髓系白血病细胞的增殖、存活的主要驱动力[9]。基于多项研究结果，多种信号通路是白血病/淋巴瘤中化疗耐药的主要原因，而STAT5参与这一系列信号通路，它在白血病/淋巴瘤的增殖中起着至关重要的作用[10]。Barbara等的研究显示，增强的STAT5A或STAT5B的作用都可以驱动外周T细胞淋巴瘤的发展，从而将这两种STAT5分子都定义为治疗干预的靶标[11]。目前临床上，一些针对STAT5蛋白的抑制剂正在进行研究，STAT5蛋白在各类肿瘤疾病中的表达情况，也是人们研究的热点，而STAT5蛋白在T-LBL中的表达特点，目前尚无定论，STAT5A及STAT5B在T-LBL的发生发展过程中的关系也需进一步的探索。

本研究中，我们用免疫组织化学方法对T-LBL中的STAT5A、STAT5B的表达进行了检测，与LH组织相比，T-LBL中的STAT5A、STAT5B的表达均明显增高，且STAT5B的表达主要是在细胞质和细胞核，而STAT5A的表达则主要集中在细胞核，此结果与Sławinska等人[12]在基底细胞癌中的报道一致。另根据免疫反应评分法，在104例T-LBL病例中，STAT5B表达强阳性者为62例，占总表达阳性者的比例为84%（62/74），而STAT5A蛋白表达阳性者为51例，占总表达阳性者比重为71%（51/72），STAT5B的表达更强烈，这表明STAT5B可能在TLBL的发生及发展中发挥更为重要的作用。

此外，STAT5B可能与维持性别差异有关，在肺组织中的实验表明，男性STAT5B的表达普遍低于女性[13]。本研究显示，STAT5A在T-LBL中的表达与患者性别有一定的相关性，男性患者的阳性表达率高于女性患者，而STAT5B的表达与患者的性别无明显的相关性，此与以前报道不符，表明STAT5B在不同组织表达中结果可能有所不同，也可能与T-LBL多发于男性患者有关。同时，本研究发现STAT5B的表达与T-LBL患者的年龄具有一定的相关性，分析显示， 60岁以上患者的STAT5B的阳性表达率明显低于60岁以下的患者，但由于本实验中60岁以上患者仅为4例，结论仅作参考。STAT5B的阳性表达与患者是否存在B 症状有关，存在B症状的患者阳性表达率较高，这一结果或可帮助临床医生进行诊断。

在生存分析中我们发现，STAT5A及STAT5B阳性表达者的总生存率均低于阴性表达者，表明二者均可独立影响T-LBL的发生和发展，而STAT5A及STAT5B共表达者人数为53，占所有患者的比例为51%，且总生存率最低，其次为STAT5A-/STAT5B+者，表明STAT5A及STAT5B均参与T-LBL疾病的发生与发展，并具有协同作用，二者在T-LBL患者中常同时高表达，预后最差，而STAT5B与T-LBL的疾病发展关系更为密切，STAT5B高表达者的生存期低于STAT5A高表达者。而STAT5A及STAT5B在T-LBL中的表达相关性不明显,表明二者在肿瘤的发生及发展过程中具有独立性影响。

综上，本研究利用免疫组织化学的方法检测了STAT5A及STAT5B的表达，证实其在T-LBL中均有异常高表达，且高表达与患者的生存预后息息相关，所以抑制STAT5A及STAT5B的表达将有利于患者的预后，可为T-LBL患者的临床诊断及预后提供一定的参考，也为T-LBL的靶向治疗提供了新的潜在的研究方向。但本研究仅限于蛋白水平，对于STAT5A及STAT5B更深层次的机制仍需进一步探讨。