二甲双胍干预FFA 诱发内质网应激介导的IR及β 细胞凋亡的机制研究*

苏晓萍 李庆铃 曾纪斌 梁奇 曹丽萍

（广东省深圳市宝安区中医院 深圳 518133）

2 型糖尿病为严重糖脂代谢紊乱综合征，而患者胰腺β 功能障碍与2 型糖尿病发生关系密切[1]。研究显示游离脂肪酸（Free Fatty Acid,FFA）与高血糖诱导胰腺组织内部活性氧大量形成相关，会导致其内部抗氧化-氧化平衡被打破，氧化应激反应被激活而造成胰腺细胞凋亡发生，使胰腺β 细胞功能损伤，进而加重糖尿病病情[2～3]。胰腺β 细胞内部存在丰富内质网，而FFA 及高糖会造成胰岛素大量分泌，导致内质网应激激活，进一步加重胰腺β 细胞功能障碍及糖尿病病情[4]。二甲双胍可以有效减轻2型糖尿病患者胰岛素抵抗，纠正机体糖代谢紊乱，目前已明确其对于2 型糖尿病糖代谢的改善主要经减轻炎症介质发挥作用[5～6]，但是其是否可以经由纠正胰腺内质网应激而减轻2 型糖尿病胰岛素抵抗，保护胰腺β 细胞尚需要进一步研究证实。基于此，本研究以FFA 构建2 型糖尿病大鼠模型，随后应用二甲双胍注射，明确其对于内质网应激激活2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗与β 细胞凋亡的影响作用机制，为后期2 型糖尿病防治提供参考意见。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 盐酸二甲双胍缓释片（注册证号H20170029），胰岛素（国药准字H32024567），血糖、胰岛素试剂盒（购自ALPCO 公司），Trizol 试剂、信使核糖核酸（Messenger RNA,mRNA）抽提试剂盒（购自赛默飞世尔科技公司），ECL 显色盒（购自美国Abbkine 公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），脱脂奶粉（购自美国BD 公司），兔抗大鼠磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated Protein Kinase B,p-AKt）、蛋白激酶B（Akt）、胰岛素受体β（Insulin Receptor β,IRβ）一抗（购自英国Abcam 公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗（购自上海碧云天生物科技有限公司）。

1.1.2 仪器 Accu-Chek Active 型罗氏血糖仪（购自罗氏血糖医护公司），1650-W 型普通台式离心机（购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），D5100型数码相机（购自日本尼康公司），702 型冰箱、2K15型台式高速冷冻离心机（购自美国Thermo 公司），TKD-TSB 型组织脱水机（购自湖北康强医疗器械有限公司），TB-718D 型石蜡包埋机（购自湖北泰维科技实业有限公司），RM2235 型石蜡切片机（购自徕卡显微系统有限公司），CX41 型号正置显微镜（购自日本奥林巴斯有限公司），041BR120387 型电泳仪以及其他相关设备（购自美国Bio-Rad 公司）；Elx800 型号酶标仪（购自BioTek 公司），ProFlex 型PCR 系统（购自赛默飞世尔科技公司）。

1.1.3 动物 SPF 级雄性大鼠购自广州赛业百沐生物科技有限公司，编号SCXK（粤）2020-0055，饲养于广州赛业百沐生物科技有限公司动物房，编号SYXK（粤）2020-0242，大鼠一共70 只，周龄为7～8周，可以自由饮食进水。

1.1.4 TBST 溶液配置 称量氯化钠（NaCl）8 g 与氯化钾（KCl）0.5 g，同时量取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris-HCl）（1M，pH 7.5）50 ml 以及吐温0.5 ml，将其混合后加水定容到1 L。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 大鼠在动物房应用正常饲料至14 周龄，选择其中50 只大鼠应用含有20%FFA 饲料进行喂养，喂养4 周后选择高血脂大鼠在尾静脉注射25 mg/m2链脲霉素，1 周后测定尾静脉血糖，随机血糖水平超过16.7 mmol/L 显示2 型糖尿病大鼠模型构建成功[7]，最终建模成功大鼠43 只。随后选择其中40 只按照大鼠胰岛素耐量、空腹血糖情况进行胰岛素给药，给药40 min 后依据大鼠体质量、三酰甘油、血糖下降百分数、胆固醇均匀分为模型组与二甲双胍组，二甲双胍组每天注入200 mg/kg 二甲双胍，取未进行建模剩下的20 只作为空白对照组，大鼠应用正常饲料喂养，空白对照组、模型组则注入与二甲双胍等体积的生理盐水，连续用药58 d，但是从用药第1 天起每隔3 d 测定1 次体质量。

1.2.2 糖代谢情况评估 在给药49 d 时大鼠正常饮水，禁食12 h，采集尾尖静脉血10 μl，测定空腹血糖、空腹胰岛素，餐后1 h 与2 h 血糖，空腹血糖、胰岛素水平。胰岛素水平应用葡萄糖氧化酶法测定，依据空腹血糖与空腹胰岛素计算胰岛素抵抗[8]，胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（mIU）/22.5。新β 细胞功能指数（Modified β-Cell Function Index,MBCI）=（空腹血糖×空腹胰岛素）/（餐后2 h 血糖+餐后1 h 血糖－7.0）。

1.2.3 动物实验与取材 所有大鼠给药52 d 后，三组大鼠每组再均分为4 组份，分别用于进行胰腺形态、胰腺β 细胞凋亡、胰腺组织内质网应激相关指标mRNA、胰腺组织内质网应激相关指标蛋白表达分析。

1.2.4 胰腺形态分析 大鼠处死，分离胰腺后采用生理盐水进行冲洗，大鼠胰腺组织擦干后需要应用Bourin's 溶液固定胰尾，随后进行石蜡包埋，进行切片后行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin Staining,HE），并在显微镜下拍片观察。

1.2.5 β细胞凋亡分析 分离胰腺组织进行石蜡包埋切片，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL）进行染色，于显微镜下观察β 细胞凋亡情况。细胞核经HE 染色后显示为蓝色，二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB）显色凋亡细胞核显示为棕黄色，拍片后每份样品需要选择6 个视野，β 细胞凋亡率选择Image J 软件进行分析，细胞凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 内质网应激相关指标mRNA 测定 收集各组胰腺组织100 mg，应用Trizol 试剂进行胰腺组织裂解后获得mRNA，应用A260/A280 比值范围为1.7～2.1 显示RNA 纯度达到标准。目的基因扩增以两步法进行，在95℃进行预变性30 s，95℃、60℃分别进行5 s、31 s，一共进行40 个循环。测定每个目标基因循环阈值（Cycle Threshold,Ct），按照2-ΔΔCt（注：ΔCt=Ct目标基因-Ctβ-actin，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组）计算目标基因表达情况，目标基因有免疫球蛋白重链结合蛋白（Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein,Bip）、CCAAT/ 增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding Protein Homologous Protein,CHOP）。见表1。

表1 引物序列

1.2.7 内质网应激相关蛋白测定 应用蛋白印迹法测定大鼠胰腺组织p-AKt、Akt、IRβ 蛋白水平。处死大鼠获得胰腺组织100 mg，应用BCA 蛋白试剂盒测定样品蛋白浓度，调整各组蛋白样品浓度，依据相关配置制备分离胶及浓缩胶进行SDS-PAGE 凝胶电泳。获得硝酸纤维素膜（NC）后进行转膜处理。用5%脱脂牛奶在摇床上封闭处理120 min，随后加入含有5%脱脂牛奶进行相应一抗处理，将其置于4℃冰箱内摇床上过夜处理。第2 天则加入对应二抗，室温环境下进行120 min 孵育。TBST 溶液完全洗膜处理后需要采用化学发光法进行显影，最后应用Image J 软件对样品蛋白灰度进行分析。

1.3 统计学方法 本研究数据采用SPSS20.0 统计学软件进行分析，计量资料以（）表示，采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠糖代谢指标水平比较 模型组与二甲双胍组大鼠体质量、MBCI 均显著低于空白对照组（P＜0.05），空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR 均显著高于空白对照组（P＜0.05）；二甲双胍组大鼠体质量、MBCI 均显著高于模型组（P＜0.05），空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR 均显著低于模型组（P＜0.05）。见图1。

图1 三组大鼠糖代谢指标水平比较

2.2 三组大鼠胰腺组织HE 染色形态分析 HE 染色结果显示，相对于空白对照组，模型组大鼠胰腺组织中存在血肿、脂肪空泡，同时可见一定炎症浸润，其边界不规则；二甲双胍组大鼠胰腺组织血肿、囊肿、脂肪空泡均显著缩小，形态则变为规则化。见图2。

图2 大鼠胰腺组织HE 染色形态分析

2.3 三组大鼠胰腺β 细胞凋亡率比较 模型组与二甲双胍组大鼠胰腺β 细胞凋亡率均显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），二甲双胍组大鼠胰腺β 细胞凋亡率显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3～4。

图3 三组大鼠胰腺β 细胞凋亡率比较

图4 大鼠胰腺β 细胞TUNEL 染色分析

2.4 三组大鼠胰腺组织内质网应激指标mRNA 水平比较 模型组与二甲双胍组大鼠Bip、CHOP 等内质网应激指标mRNA 水平均显著高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），二甲双胍组大鼠Bip、CHOP 等内质网应激指标mRN 水平均显著低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 三组大鼠胰腺组织内质网应激指标mRNA 水平

2.5 三组大鼠胰腺组织内质网应激指标蛋白表达水平比较 模型组与二甲双胍组大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等内质网应激指标蛋白表达水平均显著低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），二甲双胍组大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等内质网应激指标蛋白表达均显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图6 三组大鼠胰腺组织内质网应激指标蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究中应用FFA 饲料和链脲霉素注射构建2 型糖尿病大鼠模型，与空白对照组比较，模型组大鼠体质量、MBCI 均下降，而空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR 均上升，显示模型组大鼠出现胰岛素抵抗，胰腺β 分泌功能障碍，表明2 型糖尿病建模成功。

二甲双胍是治疗2 型糖尿病的常规药物，可以经由调节胰岛素信号通路改善高糖脂紊乱所致胰岛素抵抗，提高肝脏胰岛素敏感性，纠正异常血糖水平[9]。本研究中模型大鼠经二甲双胍处理后，大鼠胰岛素抵抗减轻，胰腺β 分泌功能障碍情况减轻，胰腺β细胞凋亡减少，显示二甲双胍确实可以有效减轻FFA 所致胰岛素抵抗，纠正大鼠脂代谢紊乱，保护胰腺β 细胞功能。转录激活因子6（Activating Transcription Factor 6,ATF6）、肌醇需求激酶1α（Inositol-Requiring Enzyme 1α,IRE1α）及蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER Kinase,PERK）共3 条信号通路，短时间内质网应激会有减轻细胞内折叠蛋白异常堆积压力，而长时间内质网应激则会促进细胞凋亡，导致机体器官功能损伤[10]。内质网应激发生时，ATF6、IRE1α、PERK3 与Bip 解离，导致其下游相关信号激活；CHOP 是内质网应激分子伴侣蛋白，其在正常状态下低表达，而在内质网应激激活后异常高表达[11]，因此模型组与二甲双胍组Bip、CHOP mRNA 水平均上升，而相对于模型组，二甲双胍组上述内质网应激指标mRNA 水平降低，表明FFA 确实可以诱导内质网应激激活，应用二甲双胍处理可以有效抑制内质网应激激活。2 型糖尿病大鼠体内CHOP 是内质网应激中细胞凋亡特异性途径，内质网应激严重则CHOP 过表达，其经由线粒体途径促进β 细胞凋亡，另一方面还可以经由调节抗凋亡和促凋亡蛋白表达水平而影响大鼠胰腺β细胞功能[12]。国外研究认为内质网应激经由上调CHOP 水平而导致2 型糖尿病发生，而将CHOP 基因敲除后胰岛β 细胞对于内质网应激敏感性下降，对于2 型糖尿病具有显著延缓作用[13]。

内质网应激与2 型糖尿病胰岛素异常关系密切，而其具体作用机制尚需要进一步研究证实。Akt 在胰岛β 细胞信号交联中相对复杂，但是胰岛素高水平所致Akt 磷酸化可以反映胰岛素信号活化情况[14]。本研究中二甲双胍组大鼠p-AKt、Akt、IRβ 等内质网应激指标蛋白表达均显著高于模型组，显示二甲双胍可以有效调节p-AKt、Akt、IRβ 蛋白表达水平，进而影响PI3K-Akt 信号通路。动物研究中2 型糖尿病小鼠应用双环醇处理后经由胰岛素信号通路磷酸化，上调p-IRβ/IRβ、p-Akt/Akt 而增强胰岛素信号通路，促进双环醇对于2 型糖尿病降糖以及胰岛素增敏作用[15]。本研究中二甲双胍对于FFA 诱导2 型糖尿病胰岛素抵抗具有显著抑制作用，对于胰岛β 细胞具有明显保护作用，其主要经由调节Bip、CHOP 等相关内质网应激mRNA 水平，进而上调p-AKt、Akt、IRβ 蛋白表达水平，减轻内质网应激紊乱，纠正糖代谢紊乱。李敏慧等[16]研究也显示胰岛素抵抗大鼠应用电针处理后Akt、IRβ 水平均显著改善，显示电针可以有效改善IRβ 活性，上调p-AKt 水平，改善下游靶基因转录，减轻大鼠胰岛素抵抗，也证实内质网应激mRNA 级相关蛋白参与介导了胰岛素抵抗过程。

综上所述，二甲双胍可以有效减轻FFA 诱导所致胰岛素抵抗，减少胰岛β 细胞凋亡，其作用机制可能与下调内质网应激相关mRNA 表达，上调胰岛素信号通路p-AKt、Akt、IRβ 蛋白水平有关。