蛋白质O-GlcNAc糖基化与心血管疾病*

赵 培， 张佳佳， 龚开政

（扬州大学附属医院心血管内科，江苏扬州 225000）

蛋白质O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化（O-linkedN-acetylglucosaminylation，O-GlcNAcylation；简称OGlcNAc 糖基化）是指单个N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）以O-糖苷键连接到底物蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上的一种蛋白质翻译后修饰。生理水平的O-GlcNAc 糖基化在代谢和免疫稳态等方面具有重要作用，其水平异常则与心血管疾病、代谢综合征和癌症等疾病的发生密切相关［1-2］。本文着重对近年来心血管疾病中涉及到O-GlcNAc糖基化的研究做简要综述，以探究蛋白质O-GlcNAc糖基化在心血管疾病中的作用，以及调控蛋白质OGlcNAc糖基化对心血管疾病的治疗意义。

1 O-GlcNAc糖基化的调节酶

与磷酸化一样，O-GlcNAc 糖基化也是一种常见的翻译后修饰。这2 种修饰的共同点在于均以蛋白质的丝或苏氨酸残基为靶点，不同点在于细胞内调节磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶有数百种，而调节OGlcNAc 糖基化的酶仅有一对，即O-GlcNAc 转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGlcNAcase，OGA）。OGT是可溶性蛋白，存在于细胞质、细胞核和线粒体，主要位于细胞核。它由2 个不同的结构域组成：N 端具有一系列34 肽重复序列（tetratricopeptide repeat，TPR），是蛋白质与蛋白质相互作用区域，可识别和激活特异性底物蛋白；C 端是催化区域，具有尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-GlcNAc 结合和酶催化位点。由于TPR 的数量不同，OGT形成了3种异构体，分别是ncOGT（nucleocytoplasmic OGT；分布于细胞核和细胞质，含有13.5个TPR，分子量是116 kD）、sOGT（short OGT；分布于细胞核和细胞质，含有2.5 个TPR，分子量是70 kD）和mOGT（mitochondrial OGT；位于线粒体，含有9 个TPR，分子量是103 kD）［2-3］。OGA 存在于细胞质和细胞核，主要位于细胞质。它由N 端的糖苷水解酶结构域、中间的茎结构域和C 端的乙酰转移酶结构域3个部分组成。OGA 有2 个异构体，分别是OGA-L（long OGA；分布于细胞质和细胞核，分子量是102 kD）和OGA-S（short OGA；分布于肌浆网和脂滴，分子量是76 kD），两者的区别在于OGA-S 缺少C 端乙酰转移酶结构域和部分茎结构域，导致其酶活性显著降低［2-3］。

OGT 以UDP-GlcNAc 为底物，添加GlcNAc 到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上，增加蛋白质OGlcNAc 糖基化水平；相反，OGA 则将GlcNAc 从蛋白质上水解去除，降低蛋白质O-GlcNAc糖基化水平［3］。O-GlcNAc 糖基化除了受到OGT 和OGA 的共同调控外，自身也可反向调节OGT 和OGA 中高度保守滞留内含子的剪接，从而控制mRNA 丰度，以维持自身水平的稳定［4］。但令人困惑的是，OGT 和OGA 这对调节酶如何特异性识别成千上万的底物蛋白质呢？为了解开这一谜团，研究者做了大量工作，在OGT的底物识别方面取得了一些进展，但有关OGA 的研究成果较少。目前认为OGT的TPR结构域在其中起着关键的作用，它不仅是底物蛋白结合区域，也是调控OGT 酶活性和稳定性的重要介质［5-6］。Liu 等［7］利用液相色谱串联质谱和突变技术发现sOGT 的TPR 结构域Thr12/Ser56位点可发生O-GlcNAc 糖基化，而这一修饰可改变sOGT 的底物选择性，进而发挥不同的功能。通过采用蛋白质微阵列技术和全蛋白质组学糖基化分析，Joiner 等［5］发现在OGT 的TPR 结构域中，远离活性位点的天冬氨酸残基决定着OGT的底物特异性，如果将这些残基突变为丙氨酸，OGT 的底物特异性也会发生改变。一项有关神经母细胞瘤的研究显示，OGT通过与p38丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）相互作用而促进神经丝蛋白重链（neurofilament heavy chain，NF-H）的O-GlcNAc糖基化［8］。由于OGT的TPR区域存在多个底物作用位点，我们推测OGT 也可能是通过与一些辅助蛋白相互作用以形成特异性全酶来实现对底物的特异性识别，即OGT 的TPR 区域与某些蛋白的相互作用决定了OGT的底物特异性。

2 己糖胺生物合成途径和O-GlcNAc糖基化的调控

细胞摄取葡萄糖后，葡萄糖在己糖激酶的催化下转化成6-磷酸葡萄糖，继而转化成6-磷酸果糖。6-磷酸果糖大部分进入糖酵解途径，但约有2%～3%进入己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway，HBP），在限速酶谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺基转移酶（glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase，GFAT）的催化下生成6-磷酸葡萄糖胺，再经过3 步酶促反应，最终生成终产物UDP-GlcNAc［9-10］。UDP-GlcNAc 是小分子高能化合物，在细胞中的数量仅次于ATP，与营养物质的代谢密不可分，其合成受葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸水平的共同调控［10］，由于UDP-GlcNAc 的产量直接影响蛋白质OGlcNAc糖基化的水平，因此认为蛋白质O-GlcNAc糖基化是细胞营养状态的感受器。由于三大营养物质之间存在相互转化，理论上，任何一种物质的代谢异常均有可能引起O-GlcNAc 水平的改变，比如高脂饮食可增加脑动脉O-GlcNAc 糖基化的水平［11］。由此可见，持续的营养过剩势必导致O-GlcNAc 糖基化水平的慢性升高，进而引发疾病。

目前，增加O-GlcNAc 糖基化水平的手段有：（1）使用葡萄糖胺或谷氨酰胺以增加HBP代谢；（2）使用OGA 抑制剂PUGNAc、Thiamet G、NAG-thiazoline 和NButGT 等；（3）使用OGA的小干扰RNA；（4）利用腺病毒过表达OGT［1］。反过来，抑制O-GlcNAc 糖基化的方法有：（1）使用重氮丝氨酸、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸等抑制GFAT；（2）使用OGT 抑制剂alloxan、TTO4 等；（3）使用底物类似物UDP-5SGlcNAc；（4）使用OGT的小干扰RNA；（5）利用腺病毒过表达OGA；（6）利用Cre-loxP 系统特异性敲除OGT基因［1］。虽然有这么多方法，但酶抑制剂的特异性并不高。比如，alloxan 既可抑制OGT，也可抑制OGA［12］。因而，研发特异性的酶抑制剂对于研究O-GlcNAc 糖基化修饰仍具有重要的意义。

3 蛋白质O-GlcNA糖基化的慢性心血管损害作用

目前认为持续的异常增加的O-GlcNAc 糖基化对人体是有害的。近年来，越来越多的研究证实在多种心血管疾病患者的体内伴随着慢性的异常增加的蛋白质O-GlcNAc 糖基化，包括动脉粥样硬化、心肌肥厚和心衰、高血压和血管功能障碍等。

3.1 动脉粥样硬化 Shrikhande等［13］发现高糖加速了ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化的发生，而抑制O-GlcNAc 糖基化可阻断高糖的促动脉粥样硬化作用。更为有趣的是，在不合并糖尿病的ApoE-/-小鼠中，抑制葡萄糖的摄入也可抑制动脉粥样硬化的形成［14-15］。既往有研究发现小檗碱通过抑制O-GlcNAc糖基化水平进而降低高糖诱导的内皮细胞氧化应激［16］。由此，我们推测通过抑制葡萄糖摄入产生的抗动脉粥样硬化作用也可能是经由降低O-GlcNAc糖基化水平实现的。那么，在动脉粥样硬化斑块中是否存在O-GlcNAc 糖基化修饰呢？为了明确这个问题，我们利用免疫荧光染色技术检测了大鼠颈动脉球囊损伤后的O-GlcNAc 糖基化情况，结果发现新生内膜中可见明显的O-GlcNAc 阳性信号（图1，未发表）。随后我们对比观察了人体健康血管和粥样硬化血管的O-GlcNAc 糖基化情况，结果发现健康内乳动脉中仅见少许散在的O-GlcNAc 阳性信号，而颈动脉硬化斑块内有大量的O-GlcNAc 阳性信号（图2，未发表）。另外，我们发现斑块内大量M1 型巨噬细胞（iNOS+）可被O-GlcNAc 糖基化修饰，而M2 型巨噬细胞（Arg-1+）偶见O-GlcNAc 阳性信号（图3，未发表）。基于上述实验，我们认为人动脉粥样硬化斑块中存在明显的O-GlcNAc 糖基化修饰，在巨噬细胞中OGlcNAc 糖基化修饰主要见于M1 型。而有关OGlcNAc 糖基化修饰在人动脉粥样硬化进程中的具体作用我们实验室正在做进一步研究。查阅文献发现已有细胞实验证实使用OGA 抑制剂Thiamet G 孵育巨噬细胞不仅可增加细胞内O-GlcNAc 糖基化修饰水平，还可促进M1型巨噬细胞中IL-1β的表达，但对M2 型巨噬细胞中Arg-1 的表达无明显影响［17］，提示O-GlcNAc 糖基化可增强M1 型巨噬细胞的促炎功能。此外，长期暴露于高糖环境或者增加葡萄糖转运蛋白GLUT1 的表达均可促进巨噬细胞向M1 型转化［18］。理论上，无论是增加葡萄糖供给还是增加GLUT1表达均可增加UDP-GlcNAc的生成，进而增加蛋白质O-GlcNAc 糖基化。因此推测在人动脉粥样硬化进程中O-GlcNAc 糖基化很可能通过促进巨噬细胞向M1 型极化，发挥促炎和促动脉粥样硬化作用。有研究发现在离体心脏中增加O-GlcNAc 糖基化可促进脂质生成［19-20］，推测O-GlcNAc 糖基化也可能是通过诱导脂质代谢异常而促进动脉粥样硬化形成。

Figure 1. O-GlcNAc modification in neointima after carotid artery balloon injury in rats（unpublished）. SMC：（vascular）smooth muscle cells. The scale bar=50 μm.图1 大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜中的O-GlcNAc修饰（未发表）

Figure 2. O-GlcNAc modification of normal and atherosclerotic human vessels（unpublished）. SMC：（vascular）smooth muscle cells. The scale bar=50 μm.图2 人健康血管和粥样硬化血管的O-GlcNAc修饰（未发表）

Figure 3. O-GlcNAc modification of M1 and M2 macrophages in human carotid atherosclerotic plaques（unpublished）. iNOS：inducible nitric oxide synthase，M1 macrophage marker；Arg-1：arginase-1，M2 macrophage marker. The scale bar=25 μm.图3 人颈动脉粥样硬化斑块中M1和M2巨噬细胞的O-GlcNAc修饰（未发表）

3.2 心肌肥厚和心衰 先前有研究显示，在压力超负荷心肌肥厚模型中UDP-GlcNAc浓度显著增加［21］；在棕色挪威大鼠年龄相关性心肌肥厚过程中GFAT和O-GlcNAc 糖基化水平逐渐增加［22］；而且动物和临床研究均显示，心衰时心脏组织中O-GlcNAc 糖基化水平升高［23-24］。有学者推测上述这些代谢产物和酶水平的变化可能是心肌能量代谢模式发生改变所致。正常情况下，成人心脏以脂肪酸氧化为主；而在心肌肥厚和心衰时，心脏脂肪酸氧化减少，碳水化合物氧化增加，类似胎儿心脏代谢模式，使得进入HBP代谢途径的葡萄糖增多，进而导致UDP-GlcNAc浓度增加、GFAT 活性增强及O-GlcNAc 糖基化水平升高；通过抑制心脏代谢模式的转变可减轻主动脉弓缩窄所致的心肌肥厚和心衰［25］。该结果支持上述推测，强调了心肌脂肪酸氧化在维持心脏正常结构和功能中的重要性，而调控O-GlcNAc 糖基化水平可能是一个潜在的治疗靶标。

也有学者发现蛋白质O-GlcNAc 糖基化与心肌肥厚密切相关［26］。活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）是具有多向调节功能的转录因子，通常以无活性的磷酸化状态存在于核外，脱磷酸化后激活、入核并激活下游信号分子，促进心肌肥厚相关基因的转录。Facundo 等［27］利用主动脉缩窄模型证实抑制O-GlcNAc 糖基化可阻止NFAT 激活及心肌肥厚，推测在心肌细胞肥大过程中NFAT的激活依赖于O-GlcNAc 糖基化修饰。近来有研究发现，AMPK的抗心肌肥厚作用也是通过降低O-GlcNAc糖基化水平实现的［28］。然而，Nakagawa 等［29］发现，提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制NFAT 和NF-κB 启动子的活性，延缓间隙性缺氧导致的心室重构。上述研究结果的不一致可能与选用不同的疾病模型有关。由于NFAT 上存在有O-GlcNAc 糖基化修饰位点［30］，我们推测NFAT 的O-GlcNAc 糖基化修饰在NFAT 介导的心肌肥厚和心室重构中可能起着关键作用。

3.3 高血压和血管功能障碍 高血压是心血管疾病的主要危险因素之一。异常的血管活性和内皮反应性，以及对缩血管物质的高敏感性是高血压和血管功能障碍的共同特点。Lima 等［31］发现，高血压大鼠的脉管系统中O-GlcNAc 糖基化水平升高，内皮依赖性血管舒张功能受损，对缩血管物质敏感性升高，用OGA 抑制剂PUGNAc 提高O-GlcNAc 糖基化水平可完全模拟出上述血管效应，提示O-GlcNAc 糖基化促进了高血压的发生发展。Kim 等［32］发现葡萄糖胺也有缩血管作用，而抑制OGT 活性后其缩血管作用消失，OGT 活性抑制后O-GlcNAc 糖基化合成减少，推测葡萄糖胺的缩血管作用可能也是通过提高OGlcNAc 糖基化水平实现的。有关O-GlcNAc 糖基化引起上述血管效应的机制主要有以下几种观点：（1）O-GlcNAc 糖基化通过抑制eNOS 磷酸化，减弱其舒血管功能［31-33］；（2）O-GlcNAc 糖基化通过增加血管对α-肾上腺素能受体激动剂的反应性而提高血管张力［31］；（3）O-GlcNAc 糖基化通过激活NADPH 氧化酶而产生过量超氧阴离子，从而减弱血管舒张功能［34］。

内皮素1（endothelin-1，ET-1）是迄今为止发现的最强的缩血管物质，在血管功能紊乱中起关键作用。有学者发现ET-1 可抑制OGA 的表达及活性，提高蛋白质O-GlcNAc 糖基化水平；而内皮素受体抑制剂阿曲生坦也可抑制ET-1 引起的O-GlcNAc 糖基化升高。另外，OGT 活性抑制剂在逆转O-GlcNAc 糖基化水平升高的同时可完全阻断ET-1 引起的缩血管作用［35］，提示ET-1 的缩血管作用可能是由O-GlcNAc糖基化介导的。

上述研究结果表明异常升高的O-GlcNAc 糖基化水平可能参与了血管功能紊乱及高血压的形成。

4 蛋白质O-GlcNAc糖基化对急性心血管损伤中心肌和血管的保护作用

自30 多年前美国科学家发现蛋白质存在OGlcNAc 糖基化修饰以来，科学家们一直关注它的慢性损害作用。然而，2004年Zachara等［36］首次提出OGlcNAc 糖基化水平的急性升高具有细胞保护作用；此后，大量研究证实了它对急性心血管损伤中心肌和血管的保护作用。

4.1 对心肌缺血再灌注损伤的作用 体内外研究均观察到心肌缺血再灌注过程中O-GclNAc 糖基化水平的变化。比如，在新生大鼠心肌细胞的缺氧/复氧研究中，缺氧/复氧可导致细胞内O-GclNAc糖基化水平上升［37］；在离体心脏的缺血再灌注研究中，缺血再灌注后心脏O-GclNAc 糖基化水平显著下降［38］；在动物的在体心肌缺血再灌注研究中，缺血预处理可提高O-GclNAc 糖基化水平［39］。在上述研究中，虽然O-GlcNAc 糖基化水平变化趋势不一致，但外源性提高O-GlcNAc 糖基化水平均可减少心肌细胞死亡，缩小心肌梗死面积，保护心功能［37-39］。Jensen 等［40］提取了人的右心房组织进行离体缺血再灌注研究，他们发现O-GlcNAc 糖基化参与介导了缺血预适应诱导的心脏保护作用。临床上对手臂进行间歇性短时间缺血和再灌注刺激可提高心肌梗死患者的心肌存活率［41］，即远程缺血预处理具有心脏保护作用。研究发现远程缺血预处理可增加心房小梁的O-GlcNAc水平，而阻碍O-GlcNAc 增加后心脏保护作用消失［40］，提示O-GlcNAc 在远程缺血预处理介导的心脏保护中也起着关键作用。

4.2 对急性血管损伤的作用 由前可知，异常升高的O-GlcNAc 糖基化水平促进了血管功能紊乱和高血压的形成。令人意外的是，O-GlcNAc 糖基化水平的急性升高具有血管保护作用。Oparil实验室发现，O-GlcNAc 水平在颈动脉内膜损伤后迅速下降，并持续长达24 h 以上；通过给予葡萄糖胺或OGA 抑制剂PUGNAc 来升高受损血管的O-GlcNAc 糖基化水平，可减少急性炎症介质的表达；如果持续给予葡萄糖胺治疗14 d 则可显著抑制新生内膜的增生［42］。在血管内膜增生中平滑肌细胞为主导细胞，因此，该团队又进行了细胞研究，他们发现提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制血管平滑肌细胞中TNF-α 诱导的炎症介质表达，并且认为O-GlcNAc 糖基化的抗炎作用是由于NF-κB 的p65 亚基发生O-GlcNAc 糖基化修饰后NF-κB 信号通路受抑制所致［43］。此外，Hilgers 等［44］发现提高O-GlcNAc 糖基化水平可抑制离体主动脉中TNF-α诱导的内皮功能紊乱。

4.3 对心脏干细胞的保护作用 有研究显示，OGlcNAc 糖基化可部分调节胚胎干细胞的多能性和重编程［45］。随后，Zafir 等［46］探讨了O-GlcNAc 糖基化在心脏干细胞中的作用，他们发现在心脏干细胞缺氧/复氧过程中蛋白质O-GlcNA 糖基化水平呈时间依赖性升高［46］。进一步研究发现，降低O-GlcNA 糖基化水平可减弱心脏干细胞的抗缺氧能力，而提高O-GlcNAc 糖基化水平可提高心脏干细胞的存活率。近年来，心脏干细胞移植已成为急性心肌梗死治疗的一种新方法，但移植后细胞的低存活率是亟待解决的问题之一。理论上，移植前在体外预先提高心脏干细胞的O-GlcNAc 糖基化水平有望提高其在梗死心肌局部的存活率，但这有待进一步验证。

5 调控蛋白质O-GlcNAc糖基化对心血管疾病的治疗意义

O-GlcNAc 糖基化对心血管系统的作用主要取决于刺激的持续时间。在急性心血管损伤中，OGlcNAc 糖基化水平的短期升高经由抗炎和介导缺血预适应等机制发挥心肌和血管的保护作用［40，43］。如果这一保护作用可被进一步证实，那么在进行心脏移植术和冠状动脉搭桥术等手术前，通过药物抑制OGA活性来提高O-GlcNAc糖基化水平，或者通过基因工程手段提高O-GlcNAc 糖基化水平，有望保护心脏和血管，改善心功能，提高生存率。相反，在心力衰竭等慢性心血管疾病中，O-GlcNAc 糖基化的慢性增加将损害心脏的正常功能。新近有学者利用OGT和OGA转基因小鼠模型证实，过度的O-GlcNAc糖基化可抑制线粒体复合体I的活性，致使线粒体能量产生功能受损，进而促进心力衰竭和死亡的发生［47］。机制方面的研究有待进一步深入。在将来，以下几点仍需着重探讨：在心血管疾病发生发展中哪些蛋白质的O-GlcNAc 糖基化修饰水平是发生变化的（升高或降低）？蛋白质O-GlcNAc 糖基化修饰的具体位点？O-GlcNAc 糖基化修饰对靶蛋白功能的影响？毫无疑问，这些问题的明确将使通过外源性调控靶蛋白O-GlcNAc 糖基化水平来治疗心血管疾病成为可能。考虑到O-GlcNAc 糖基化在人体疾病中的复杂作用，针对不同疾病给予器官特异性、蛋白质靶向性的O-GlcNAc糖基化调控更具可行性。

总而言之，O-GlcNAc 糖基化水平的短期急性升高对急性心血管损伤中的心肌和血管具有保护作用，而O-GlcNAc 糖基化的长期慢性增加参与了慢性心血管疾病的发生发展。深入探讨O-GlcNAc 糖基化在心血管疾病发生发展中的作用，有助于我们深入理解心血管疾病的发病机制，从而为临床研发新药提供理论依据。