黄芩苷通过Notch通路纠正细支气管炎模型小鼠Th17/Treg失衡*

吴琳琳， 梁东阁， 何倩倩， 曹 欢

（郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院呼吸科，河南郑州 450053）

细支气管炎（bronchiolitis，BC）为多发于婴幼儿的急性呼吸道感染性疾病，可能导致哮喘等后遗症，威胁儿童健康。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是导致BC 的主要病原菌之一，具有高度传染性和致病性，且机体无法对其产生充足的免疫反应，可能重复感染，目前仍缺乏相应的疫苗［1］。研究发现，发挥促炎作用的辅助性T 细胞17（T helper 17 cells，Th17）与抑炎作用的调节性T细胞（regulator T cells，Treg）的比例失衡，进一步导致机体Th2 免疫应答增强，引起炎症反应［2］。因此，抑制Th17 细胞分化，诱导Treg 分化可能有效改善BC 症状。而Notch 通路的激活可促进Th17 分化，抑制Treg 分化，在调节T 细胞分化中发挥重要作用［3］。另有研究证实，Notch 通路在BC 模型动物中处于激活状态，且抑制Notch 通路可减轻BC 大鼠气道炎症［4］。

黄芩苷为传统中药黄芩分离的黄酮类物质，具有消炎和抗病毒等活性［5］。多项研究表明，黄芩苷对柯萨奇B3 病毒［6］和乙肝病毒［7］等所致疾病均具有改善作用。最近研究显示，黄芩苷在体内和体外都可抑制RSV 病毒复制［8］，但具体作用机制并未明确。本研究采用黄芩苷治疗RSV 感染的BC 模型小鼠，并通过检测Notch 通路相关蛋白的表达、Th17 和Treg细胞比例及转录因子和细胞因子表达水平，分析Notch 通路在黄芩苷纠正BC 模型小鼠Th17/Treg 失衡中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 40 只健康雄性BALB/c 小鼠，7 周龄，体重20～24 g，购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK（豫）2017-0001。

1.2 病毒 将RSV 接种于HeLa 细胞中进行增殖培养，所用培养基为RPMI-1640（含10%胎牛血清），待细胞病变达80%左右时，收集病毒上清备用，另收集未接种RSV 的细胞空白培养基上清备用。经空斑试验测得本实验中RSV滴度为1.0×1010PFU/L。

1.3 主要试剂及仪器 黄芩苷和羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）均 购 自Sigma；Notch1 激活剂重组小鼠Jagged1 蛋白、兔抗Hes1 和β-actin 单抗、兔抗Hey2 和activated Notch1 多抗及羊抗兔和大鼠IgG Ⅱ抗（Abcam）；抗CD4-APC、IL-17-PE、CD4-FITC、CD25-PE 和 叉 头 框 蛋 白P3（forkhead box protein P3，FOXP3）-APC（Invitrogen）；视黄酸受体相关孤儿受体γt（retinoic acid receptorrelated orphan receptor γt，RORγt）大鼠单抗（BD Biosciences）；HE 试剂盒及小鼠转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）、IL-17 和IL-10 ELISA 试剂盒（上海生工）。转膜系统和酶标仪（Bio-Rad）；荧光显微镜（Olympus）；多功能酶标仪和流式细胞仪（BioTek）；切片机（Leica）。

2 方法

2.1 模型的制备及分组 将小鼠随机分为4 组，每组10 只。正常组连续2 d 每日经鼻滴入100 μL 空白培养基上清，每日腹腔注射10 mL/kg 0.5% CMC-Na溶液，共7 d。BC 组连续2 d 每日经鼻滴入100 μL 病毒培养基上清［9］，每日腹腔注射10 mL/kg 0.5%CMC-Na 溶液，共7 d。黄芩苷组连续2 d 每日经鼻滴入100 μL 病毒培养基上清，每日腹腔注射10 mL/kg黄芩苷混悬液（按200 mg/kg 的剂量［8］溶于0.5%CMC-Na 溶液），共7 d。BC+黄芩苷+Jagged1 组连续2 d每日经鼻滴入100 μL病毒培养基上清，每日腹腔注射10 mL/kg黄芩苷和Jagged1的混悬液（按200 mg/kg 黄芩苷+1 mg/kg Jagged1 的剂量溶于0.5% CMCNa 溶液），共7 d。末次给药24 h 后，取肺组织，左肺组织用于病毒滴度测定、炎症因子及蛋白表达检测，右肺组织部分用于流式细胞术分析，部分浸入4%多聚甲醛中固定制作组织切片。

2.2 HE 染色 将2.1 中右肺切片（4 μm），遵循试剂盒说明分别与苏木素染液和伊红染液孵育后，光镜下观察并进行病理学评分。

2.3 流式细胞术检测 采用Percoll 液分离2.1 中右肺组织单个核细胞，用流式缓冲液将细胞浓度调整为1×109L-1，取100 μL 加入流式管，与抗CD4-APC和IL-17-PE 单抗避光孵育20 min，取400 μL 上流式细胞仪进行检测，设门CD4 和IL-17 检测Th17 细胞数量，即CD4+IL-17+；另外与CD4-FITC、CD25-PE 和FOXP3-APC 单抗避光孵育20 min，设门CD4、CD25和FOXP3检测Treg数量，即CD4+CD25+FOXP3+。

2.4 空斑实验 取100 mg 左肺组织按照1 g/mL 的比例加入RPMI-1640 培养液制备匀浆液，取上清液接种于HeLa 细胞，孵育60 min 后，弃去上清，加入含有1.5% CMC-Na 的培养液，37 ℃培养箱中孵育7 d，用0.1%的结晶紫溶液染色后计数空斑数量，以此表示肺组织中病毒滴度。

2.5 Western blot 实验 取100 mg 左肺组织，使用RIPA 缓冲液裂解后离心，保存上清液并用BCA 法定量蛋白浓度。每组取30 μg蛋白煮沸后上样电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF 膜并用5%脱脂奶粉封闭，然后分别与Ⅰ抗［Hes1（1∶300）、Hey2（1∶250）、activated Notch1（1∶500）、RORγt（1∶250）、FOXP3（1∶500）和β-actin（1∶500）］4 ℃过夜反应，洗膜3 次后，在室温下与Ⅱ抗（1∶1 000）反应1 h，加入ECL 显影1 min，放入TANON成像系统曝光并拍照分析。

2.6 ELISA 取100 mg左肺组织，加入预冷的PBS，匀浆、离心后保留上清液，遵循TGF-β、IL-22、IL-17和IL-10 ELISA 试剂盒说明依次加入相应试剂，在酶标仪上检测各组在450 nm处的吸光度（A），参考标准曲线计算各组样品中TGF-β、IL-22、IL-17和IL-10水平。

3 统计学处理

采用SPSS 24 和GraphPad Prism 8.0 行统计分析。实验数据用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 黄芩苷对小鼠肺组织的影响

正常组肺组织形态正常，肺泡壁间隔均匀，未见血管破裂；BC 组肺泡壁和肺泡间隙可见较多炎症浸润，肺泡壁增宽和血管破坏，病理评分明显高于正常组（P＜0.05）；黄芩苷治疗可减轻上述组织损伤，病理评分明显降低（P＜0.05）；而Notch 激活剂Jagged1 可逆转黄芩苷的改善作用，见图1、表1。

Figure 1. Morphological Observation of lung tissue in mice（HE staining）.图1 小鼠肺组织形态观察

2 黄芩苷对小鼠肺组织RSV载量的影响

正常组未检测到RSV；BC 组肺组织RSV 载量为（10.53±2.81）×104PFU/（g tissue）；黄芩苷治疗后肺组织RSV 载量降低至（4.72±1.43）×104PFU/（g tissue），显著低于BC 组（P＜0.05）；而BC+黄芩苷+Jagged1 组RSV 载量显著高于BC+黄芩苷组（P＜0.05），见表1。

表1 小鼠肺组织病理评分及RSV载量Table 1. Pathological score and RSV load of lung tissue in mice（Mean±SD. n=10）

3 黄芩苷对小鼠肺组织Th17 和Treg 细胞比例及其细胞因子水平的影响

与正常组相比，BC 组Th17 细胞比例及IL-17 和IL-22水平升高，Treg细胞比例及IL-10和TGF-β水平降低（P＜0.05）；与BC 组相比，BC+黄芩苷组Th17 细胞比例及IL-17 和IL-22 水平降低，Treg 细胞比例及IL-10 和TGF-β 水平升高（P＜0.05）；与BC+黄芩苷组相比，BC+黄芩苷+Jagged1 组Th17 细胞比例及IL-17和IL-22 水平升高，Treg 细胞比例及IL-10 和TGF-β水平降低（P＜0.05），见图2、表2。

表2 小鼠肺组织Th17细胞比例、Treg细胞比例及其细胞因子水平的比较Table 2. Comparison of Th17 proportion，Treg proportion and their cytokine levels in lung tissues of the mice（Mean±SD. n=10）

Figure 2. Proportion of Th17 and Treg cells in lung tissue of mice detected by flow cytometry.图2 流式细胞术分析小鼠肺组织Th17和Treg细胞的比例

4 黄芩苷对小鼠肺组织FOXP3、RORγt 和Notch通路蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，与正常组相比，BC 组的FOXP3 蛋白水平降低，RORγt 蛋白水平升高（P＜*P＜0.05vsnormal group；#P＜0.05vsBC group；△P＜0.05vsBC+baicalin group.0.05）；与BC 组相比，BC+黄芩苷组的FOXP3 蛋白水平水平升高，RORγt蛋白水平降低（P＜0.05）；与BC+黄芩苷组相比，BC+黄芩苷+Jagged1 组的FOXP3 蛋白水平水平降低，RORγt 蛋白水平升高（P＜0.05）。与 正 常 组 相 比，BC 组 的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高（P＜0.05）；与BC 组相比，BC+黄芩苷组的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平降低（P＜0.05）；与BC+黄芩苷组相比，BC+黄芩苷+Jagged1 组的activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高（P＜0.05）。见图3。

Figure 3. Effect of baicalin on the expression of FOXP3，RORγt and Notch pathway-related proteins. A：normal group；B：BC group；C：BC+baicalin group；D：BC+baicalin+Jagged1 group. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；△P＜0.05 vs C.图3 黄芩苷对FOXP3、RORγt和Notch通路相关蛋白表达的影响

讨 论

在受到外源性病毒感染后，机体的T 细胞可识别病毒抗原，激活抗体介导的免疫反应和细胞毒性反应，进而控制病毒感染，CD4+T 细胞在该过程中发挥协调作用。T细胞受体被激活后，CD4+T细胞进一步分化为Th1、Th2、Th17 和Treg 等细胞亚群，目前研究已确定Th17/Treg 失衡在病毒感染类疾病中发挥重要作用［10］。

Th17 细胞分化的主要调节因子为RORγt，可分泌IL-17 和IL-22 等，在RSV 感染期间可诱导黏液产生，增强Th2 应答，刺激肺嗜中性粒细胞浸润，抑制CD8+T 细胞对病毒的清除，促进RSV 所诱导的呼吸道炎症和功能障碍，在BC 患儿疾病进展中发挥促进作 用［11］。而Treg 细 胞 可 拮 抗Th17 细 胞 的 功 能，FOXP3 为诱导其分化的关键转录因子，可通过分泌TGF-β 和IL-10 等抑炎因子，减轻炎症浸润，促进病毒清除，避免过度先天和细胞免疫应答，抑制Th2 应答，在抵抗胞外病原体入侵和抑制自身免疫中起着保护作用［12］。本研究发现，黄芩苷治疗后BC 小鼠肺组织炎性浸润、肺泡壁增宽等损伤减轻，且Th17 细胞比例、IL-17、IL-22 水平及RORγt 蛋白水平明显降低，Treg 细胞比例、IL-10、TGF-β 水平及FOXP3 蛋白水平明显增高。Mangodt 等［13］指出，从Treg 向Th17转化具有可塑性，RSV 感染期间，肺部Th17 比例升高，Treg 降低，导致病毒清除延迟和疾病严重性增加。因此，调控Th17/Treg 平衡可能有利于RSV 的清除。我们的研究提示黄芩苷在调节Th17/Treg 细胞分化中发挥作用，与蔡志波等［14］研究一致。Pang等［15］研究认为，黄芩苷通过下调RLRs 信号通路，降低Th1/Th2 和Th17/Treg 比例，控制甲型流感病毒感染并改善预后。本研究推测，黄芩苷通过上调FOXP3 表达促进Treg 细胞分化，并下调RORγt 表达抑制Th17 分化，进而促进CD8+T 细胞对RSV 的清除［8］，减轻BC小鼠呼吸道炎症。

Notch 通路是重要的信号传导途径，可以通过抑制细胞分化，调节机体炎症反应并维持免疫平衡。Notch 通路在CD4+T 细胞分化为Th17 和Treg 细胞及二者相互转化中起重要调节作用［16］。本研究结果显示，与正常组相比，BC 组activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平升高，采用黄芩苷治疗后，BC 小鼠肺组织activated Notch1、Hes1 和Hey2 蛋白水平均明显降低，趋于正常组。临床证据表明，在过敏性哮喘患儿中，Notch 蛋白高表达且Th17/Treg 比例升高；在支原体肺炎患儿中，Notch 通路蛋白Notch1 和Hes1 及Th17/Treg 转录因子Foxp3 和RORγt 均高表达，Th17细胞、Th17/Treg 比例增高，Treg 细胞比例较低［17-18］。Qin等［19］发现，在RSV感染的模型动物肺组织中存在Notch 通路活化，并伴有高水平的Th17 分化，认为Notch1 通路的活化诱导了气道微环境中CD4+T 细胞向Th17 分化，从而导致RSV 相关哮喘的发生和发展。而靶向Notch 通路的抑制剂可通过抑制Th17 反应，增加Treg分化，减轻RSV 所致气道高反应性和肺部炎症［20-21］。本研究进一步发现，黄芩苷对BC 小鼠的改善作用及对Th17/Treg 比例的调节作用可被Notch1 激活剂阻断，因此，推测黄芩苷可能通过对Notch通路的抑制而发挥对BC小鼠的治疗作用。

综上所述，黄芩苷可能通过Notch 通路纠正Th17/Treg失衡来发挥对BC的治疗作用，进一步丰富了其药理机制。然而其它通路也可能在该过程中发挥作用，有待继续探究。