GTP酶免疫相关蛋白5在调控肺炎克雷伯菌感染大鼠致病性CD4+T细胞发育中的作用*

张 臣， 王艳丽， 黄中炎， 付晓荣， 王 勉， 张 丽， 汪晓婷△

［1武汉市武昌医院（武汉科技大学附属武昌医院）儿科，湖北武汉 430063；2华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院（武汉市妇幼保健院）小儿呼吸二内科，湖北武汉 430016］

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种革兰氏阴性杆菌，通常存在于下消化道。在免疫防御受损或气道清除机制受损的患者中，KP 可引起下呼吸道的严重感染［1］。目前，关于KP 诱导下呼吸道感染的发病机制尚未完全清楚。最近的研究表明，KP 感染与Th1/Th17 CD4+T 细胞的存在有关［2］。此外，KP 感染患者的肺部、痰液和血液中白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）或IL-17A+CD4+T细胞水平与疾病严重程度相关［3］。然而，导致KP 相关感染的遗传和环境因素仍不清楚。GTP 酶免疫相关 蛋 白5（GTPase of immunity-associated protein 5，GIMAP5）对淋巴细胞的存活至关重要，GIMAP5缺陷的CD4+T细胞在抗原刺激下表现出生存受损和DNA损伤增加［4］。在啮齿类动物和人类受试者中，GIMAP5丧失功能突变会导致淋巴细胞减少，免疫耐受丧失，随后出现自身免疫性疾病［5］。在GIMAP5缺陷小鼠中，表现为CD4+T 细胞驱动的结肠炎［6］。但目前尚不清楚KP感染是否通过调节GIMAP5的活性来控制T 细胞发育。因此，本项工作以大鼠CD4+T 细胞为研究对象，探讨KP感染对细胞中GIMAP5表达、T细胞激活及Th17和Th1细胞体外发育的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

动物：从北京协和医学院实验动物研究所获得20 只Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠［SPF 级，200～250 g，3 月龄，生产许可证号为SCXK（京）2017-0005］。动物在标准条件下饲养，均可自由获得标准饲料和水。

菌株：KP 菌株购自中国科学院微生物研究所，在营养琼脂培养基上培养，用生理盐水稀释为2.4×1011CFU/L，在动物体内进行KP诱导。

2 方法

2.1 细胞分离和培养 使用CD4+T 细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotech）从大鼠脾细胞中获得CD4+T 细胞。将细胞接种在含10%热灭活胎牛血清（Sigma-Aldrich）、55 μmol/L 2-巯基乙醇（Gibco）、1×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素（Sigma-Aldrich）的RPMI-1640 培养液（含L-谷氨酰胺；Gibco）中，加入抗CD3和抗CD28抗体（浓度分别为1和2 mg/L）进行体外细胞刺激，观察不同刺激时间（24、48 和72 h）对CD4+T细胞GIMAP5 表达的影响。为了诱导大鼠T 细胞亚群，在下列细胞因子和抗体的存在下激活细胞［4］：对于Th1细胞，使用20 μg/L IL-12和5 mg/L 抗大鼠IL-4抗体；对于Th17 细胞，使用0.5 μg/L 转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、50 μg/L IL-6、10 μg/L IL-23、10 μg/L IL-1β、5 mg/L 抗大鼠IFN-γ 抗体和5 mg/L 抗大鼠IL-4 抗体；对于调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg），使用5 mg/L TGF-β。抗体从BD Biosciences 购买，而细胞因子则从Miltenyi Biotech、Immunotools 或BioLegend 购买。对于CD4+T细胞活化和发育实验，将CD4+T 细胞分为对照（control、CTRL）组、KP 组和KP+GIMAP 组。除对照组外，将培养至对数生长期的KP 用PBS 稀释至2.4×1011CFU/L，并按感染复数100∶1 的比例混合细菌与CD4+T 细胞共孵育6 h。此外，KP+GIMAP5 组加入GIMAP5重组蛋白（广州锐博生物科技有限公司设计并合成）25 μmol/L，在37 ℃下预培养72 h。然后，各组加入抗CD3和抗CD28抗体（浓度分别为1和2 mg/L）体外刺激细胞48 h。收集细胞，进行以下测试。

2.2 Western blot检查 收集培养细胞并在Laemmli样品缓冲液中裂解，然后在95 ℃条件下加热5 min。用BCA 蛋白定量分析试剂盒（Thermo Scientific）测量蛋白浓度。蛋白样品在SDS-PAGE 上分离，并转移到PVDF 膜上。用1∶1 000 稀释的Ⅰ抗（GIMAP5 和GAPDH）和1∶2 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG抗体（均购自Cell Signaling Technology）检测蛋白表达水平。以GAPDH为内参照。

2.3 RT-qPCR 实验 使用Purelink RNA Mini 试剂盒（Invitrogen）分离RNA。利用高容量cDNA 反转录试剂盒（Applied Biosystems）将RNA 转化为cDNA，并在Applied Biosystems 7500 型荧光定量PCR 仪上进行RT-qPCR 检测。mRNA 表达水平用2-ΔΔCt法计算。GAPDH 的正向引物序列为5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′，反向引物序列为5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′；GIMAP5 的 正 向 引 物 序 列 为5′-TACCAGGAGCCCATTCACAAC-3′，反向引物序列为5′-GCCACAGGACATCAGCCAAGAA-3′。

2.4 流式细胞术 除了早期IL-2 生成的评估在激活后24 h 进行外，其他所有的流式细胞术都是在激活后3 d 进行的。所有流式抗体采用1∶200 稀释。为了分析细胞增殖，细胞在激活前用CellTrackerTMViolet（CTV；Invitrogen）进行预染色。用CTV 稀释法评估细胞增殖水平。为了评估T 细胞的活化，收集洗涤细胞，并用抗大鼠CD44 和CD25 抗体染色。细胞内细胞因子染色：收集细胞并洗涤，用50 mg/L PMA+1 mg/L 离子霉素+10 mg/L 布雷菲尔德菌素A（均购自Sigma-Aldrich）重新刺激，4 h 后，冲洗细胞，用固定和渗透缓冲液（BioLegend）固定/渗透，并用抗大鼠IL-2、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-17A 染色。对于Treg 检测，首先用抗大鼠CD25 抗体染色，然后用Foxp3/转录因子染色缓冲液组（Invitrogen）固定/渗透细胞，并用抗大鼠Foxp3 抗体孵育。所有样本均在FACS Canto Ⅱ细胞分析仪（BD Biosciences）上处理。使用FlowJo软件对采集的数据进行分析。

2.5 RNA 测序与转录组学分析 RNA 测序与转录组学分析由北京博奥生物有限公司完成。总RNA使用Qubit 2.0（Thermo Fisher Scientific）进行量化。采用独创性路径分析（Qiagen）进行无偏路径分析。只有计算出KP 处理组与Th0 对照组差异表达变化＞±1 倍且P＜0.05 的基因才被考虑用于通路分析。为了生成特定基因集的热图，使用了Morpheus 软件（Broad Institute）。基因列表是从公开可用的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）数据库（Broad Institute）中获得的，这些基因集的折叠改变基因表达在KP 处理的Th0 和对照Th0 RNAseq 数据中被量化。只有KP 处理组与对照组样本差异表达变化＞±1倍且调整后P＜0.05的基因才被纳入显示原始读取计数值的热图中。

3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析，以均值±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用Student 双尾检验，多组间比较采用方差分析和Sidak多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CD3/CD28 刺激后CD4+T 细胞中GIMAP5 的表达上调

CD4+T 细 胞 受CD3/CD28 刺 激 后，GIMAP5 的mRNA 和蛋白水平与刺激前相比均显著上调（P＜0.05），见 图1A、B。此 外，CD3/CD28 刺 激 导 致GIMAP5在细胞中呈时间依赖性积累，见图1C。

Figure 1. CD3/CD28 activation induced the up-regulation of GIMAP5 expression in CD4+ T cells of rats. A：relative mRNA level of GIMAP5 in resting and activated CD4+T cells was detected by RT-qPCR；B：Western blot showed the expression and quantitative analysis of GIMAP5 protein in CD4+ T cells after activation；C：the protein expression of GIMAP5 in activated CD4+T cells was analyzed by Western blot. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs resting group.图1 CD3/CD28激活诱导大鼠CD4+T细胞GIMAP5表达上调

2 KP感染阻断大鼠CD4+T细胞活化

为了测试KP 感染对T 细胞功能的影响，本研究用KP 感染CD4+T 细胞。结果显示，在CD3/CD28 激活期间，用KP 处理大鼠CD4+T 细胞可降低活化T 细胞中GIMAP5 的水平，见图2A。然后研究分析了KP感染对T 细胞功能的影响。在CD3/CD28 刺激后24 h，与对照组细胞相比，KP 感染组中产生IL-2 的细胞显著减少（P＜0.01），加入GIMAP5 重组蛋白可恢复IL-2 的产生（P＜0.05），见图2B。与这些结果一致，KP处理抑制大鼠CD4+T细胞的增殖（P＜0.01），加入GIMAP5 重组蛋白促进了CD4+T 细胞增殖（P＜0.01），见图2C、D。

Figure 2. KP infection blocked the CD4+ T cell activation in rats. A：Western blot was used to detect the protein expression of GIMAP5 in the CD4+T cells after KP treatment；B：the percentage of IL-2+cells after KP treatment was detected by flow cytometry；C：representative flow cytometry chart showing fluorescent CellTracer ™Violet to assess T cell proliferation；D：FlowJo software was used to calculate the division index to quantify T cell proliferation. Measn±SD. n=6.**P＜0.01 vs control（CTRL）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs KP group.图2 KP感染阻断大鼠CD4+T细胞活化

3 KP感染促进Myc、HIF-1α和mTORC1信号转导

独创性路径分析预测了KP 参与上调T 细胞激活的关键信号通路，其中包括Myc、HIF-1α 和mTOR通路，见图3A。据此，基因表达分析证实，KP感染在体外促进了CD4+T 细胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所调节的基因的上调，见图3B。由于HIF-1α、Myc 和mTORC1 是T 细胞有氧糖酵解和Warburg 样代谢的关键调节因子［7］，进一步RNA序列分析结果表明，KP感染处理显著促进了激活后T 细胞中几种糖酵解基因的上调，见图3C。

Figure 3. KP infection promoted HIF-1α，Myc and mTORC1 signaling transduction. A：original pathway analysis predicted that KP up-regulated Myc，HIF-1α and mTOR regulatory pathways；B：the thermography showed the expression of the genes regulated by Myc，HIF-1α and mTOR in T cells activated by DMSO（Th0 CTRL）or KP（Th0 KP）；C：the thermography showed the expression of glycolytic genes in Th0 CTRL and Th0 KP cells.图3 KP感染促进了HIF1-α、Myc和mTORC1信号转导

4 PK感染促进Th17和Th1细胞的发育

流式细胞术分析显示，与对照组相比，KP 感染后Th17 细胞和Th1 细胞的比例显著升高（P＜0.01），加入GIMAP5 重组蛋白可阻断Th17 和Th1 细胞的发育，见图4A、B。重要的是，本研究还观察到KP 感染耗尽Treg 群体（P＜0.01），加入GIMAP5 重组蛋白可诱导Treg产生（P＜0.01），见图4C。

Figure 4. Flow cytometry was used to evaluate the percentages of Th17+ cells（A），Th1 cells（B），and Treg（C）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs CTRL group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs KP group.图4 流式细胞术测定Th17细胞、Th1细胞和Treg的比例

讨 论

KP 因其可引起广泛感染及高水平抗生素耐药性而备受关注［8］。作为对KP 感染的反应，宿主会触发强烈的体液和细胞免疫反应，包括肺固有层CD3+CD4+T 细胞增多和T 细胞浸润。小鼠肺部KP 感染是最早证明IL-17A对宿主细胞防御外细菌感染重要性的传染病模型之一［9］。近年来，研究显示KP 感染的CD4+T细胞在抗原刺激下表现出生存受损和DNA损伤增加［10］。GIMAP5蛋白主要在淋巴细胞中表达，并在发育、选择和稳态过程中调节淋巴细胞存活［11］。然而，目前关于KP 感染是否通过调节GIMAP5 的活性来控制T细胞活化却从未被研究过，尤其是在T细胞亚群的背景下。本研究显示GIMAP5在CD3/CD28刺激后表达上调，并积聚在CD4+T 细胞中；KP 感染显著降低了GIMAP5 表达，严重影响T 细胞活化，并促进了促炎性Th17和Th1细胞的体外发育。

GIMAP5可以被转运到增殖细胞的细胞核，发挥不同的功能，如组蛋白磷酸化和基因转录调控，包括调控Myc转录和与HIF-1α相互作用以促进HIF-1α依赖基因的表达，编码参与糖酵解的酶［4］。GIMAP5 也被证明通过mTORC1抑制富含脯氨酸的AKT1底物1的磷酸化或通过减少丝氨酸的合成来调节转化细胞中mTORC1的活性，且GIMAP5可在增殖细胞中维持mTORC1 功能［12］。本研究结果表明，GIMAP5 的活性可能通过控制HIF-1α、mTORC1 和Myc 的功能，以及T 细胞受体激活的CD4+T 细胞中有氧糖酵解的参与而调控，这些是其激活的关键因素［7］。值得注意的是，静息T细胞细胞核中GIMAP5的水平较低，先前的研究表明HIF-1α和Myc的活性可能由mTORC1自身控制［13］。因此，抑制GIMAP5的活性可以阻断HIF-1α和Myc在CD3/CD28刺激下的高表达水平。这些结果可以解释KP 体外感染促进了CD4+T 细胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所诱导的基因的上调。因此，KP 感染可能对T细胞代谢有更广泛的影响。

本研究还表明，KP 感染诱导促炎性Th17 和Th1细胞的发育，且抑制Treg 生成，从而抑制体内自身免疫。先前的研究表明，诱导mTORC1、Myc 和HIF-1α可以抑制炎症条件下Foxp3+T细胞的发育［14-15］。其他研究表明，糖酵解和mTORC1/HIF-1α 活性抑制有利于Treg 的生成［16］。而抑制有氧糖酵解可限制小鼠模型和人类疾病中T 细胞介导的Th17 生成和发展［17］。鉴于本研究结果表明KP在体外可阻断TGF-β诱导的Treg，因此需要进一步研究GIMAP5 在Treg 生成和功能中的重要性。此外，为了进一步确认GIMAP5在介导KP 感染引起的T 细胞激活和致病性中的作用，应进一步在体内模型中分析GIMAP5基因缺失对KP感染大鼠T细胞功能的影响。

综上所述，影响GIMAP5 活性可能是限制KP 感染诱导T 细胞致病性的一个潜在途径。本研究支持这样一种观点，即通过上调T细胞中GIMAP5的表达来限制Th1/Th17 的发育是治疗KP 感染的一种有价值的方法。