骆驼蓬内生细菌多样性与抗菌活性研究

张耀星，朱玉芳，柳耀年，石娜娜，张淼森，夏占峰

（塔里木大学生命科学学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

骆驼蓬为蒺藜科多年生草本植物，具有止咳平喘，祛风湿，消肿毒等功效，并具有较好的抗肿瘤活性，对中枢神经系统和心血管系统具有保护作用，还具有单胺氧化酶的抑制作用、抗菌作用、辐射防护作用和抗包虫作用等[1]。骆驼蓬植株及其种子富含多种生理活性物质，其中主要有效成分是骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱等生物碱[2]。美国西奈山伊坎医学院COHEN J等[3]发现在培养物中添加去氢骆驼蓬碱可驱动产生胰岛素的人类β细胞进行持续分裂和增殖，骆驼蓬碱处理可使β细胞的数量增至三倍，在模拟人类糖尿病的三组转基因小鼠中能够更好的控制血糖。最新研究表明，骆驼蓬碱还具有一定的杀虫活性，近年来药用植物内生菌也是较为火热的研究对象，内生细菌几乎存在于所有的植物中，它们与植物互利共生，在促进植物生长、提高抗逆性与产生活性化合物等方面起着重要作用[4]。骆驼蓬作为药用植物，针对其药用成分及活性研究较多，而但针对其内生菌开展的研究鲜有报道。本研究通过SOB、TSB等多种培养基分离骆驼蓬内生细菌，对分离获得的骆驼蓬内生细菌进行种类鉴定探索其物种多样性。采用平板对峙法和孔碟法，以解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovory）为靶标进行抑菌活性筛选，获得多个抑菌活性菌株，为骆驼蓬内生菌资源的开发和利用提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

2019年6月，从塔克拉玛干沙漠西缘十二团场十连（81°30′10″E，40°45′02″N）采集骆驼蓬根、茎、果实，样品采集后装于自封袋中，置于4℃冰箱保存备用。

1.2 供试靶标菌

Erwinia amylovory为革兰氏阴性细菌，能引起苹果、梨等果树病害[5-7]。由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室提供。

1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，氯化钠5.0，琼脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

SOB培养基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，氯化钠0.5，氯化钾 0.2，氯化镁 0.1，琼脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

TSB培养基（g/L）：胰蛋白胨17.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，氯化钾5.0，磷酸氢二钾2.5，琼脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

YMA培养基（g/L）：酵母提取物1.0，甘露醇1.0，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.2，氯化钠0.1，碳酸钙1.0，琼脂粉18.0，pH 7.4～7.6。

MC培养基（g/L）：大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母膏粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，中性红0.05，琼脂粉18.0，pH 6.0。

YEB培养基（g/L）：牛肉浸膏5.0，酵母浸膏1.0，蛋白胨5.0，蔗糖5.0，七水硫酸镁0.5，琼脂粉18.0，pH 6.9～7.1。

ISP2培养基（g/L）：酵母提取物4，葡萄糖4，麦芽糖10，硫酸铁0.05，硫酸锌0.05，氯化锰0.05，琼脂粉18，pH 7.4～7.6。

高糖培养基（g/L）：牛肉浸膏8.0，蔗糖50.0，放线菌酮0.05，溴百里酚兰0.05，中性红0.0125，琼脂粉18.0，pH 7.0。

1.4 样品处理

表面消毒：骆驼蓬样本用自来水洗净，将植株的根、茎、果实分别处理，茎与根切成约1 cm长的小段，浸泡于75%酒精40 s，浸泡于1 g/L次氯酸钠溶液8 min，再浸泡于75%酒精40 s，最后用无菌水冲洗5遍。保留最后一次冲洗的无菌水，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，常温培养，检测表面消毒效果。

菌液制备：根、茎、果实样本消毒完成后，在无菌环境下加入生理盐水研磨，制成菌液备用，以10倍梯度稀释，配制3个梯度。

1.5 骆驼蓬内生菌的分离与保藏

吸取各梯度菌液0.5 mL涂布于不同分离培养基上，每种培养基及梯度设置三个重复，32℃下倒置培养，3～5 d后挑取各种形态的菌落，采用三区划线法纯化，获得纯培养[8]。以甘油（30%）作为保护剂，保藏于-20℃。

1.6 骆驼蓬内生细菌的种类鉴定

采用酶解法提取内生菌的基因组DNA[9]，采用通用引物27F和 1492R进行PCR扩增16S rDNA[10]，电泳检测[11]PCR产物。寄送PCR产物至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果采用SeqMan软件进行序列拼接，用EZbiocloud数据库进行16S rDNA序列相似度比对[12]，判断微生物的种类。

1.7 抑菌活性菌株的筛选

初筛采用平板对峙方法[13]对分离获得的菌株以解淀粉欧文氏菌为靶标进行抑菌活性筛选。取待测菌菌饼放置在涂有靶标菌的高糖培养基上，28℃培养48 h。设置平行实验3组，记录抑菌圈产生情况。（抑菌圈半径=待测菌菌饼边缘至靶标菌菌苔边缘）

复筛采用孔碟法。挑取初筛阳性菌株进行液体发酵培养，5 d后离心，分别收集上清液和菌体，上清液45℃烘干后用甲醇溶解获得发酵液粗提物，菌体烘干后用甲醇溶解获得菌体粗提物。将涂有靶标菌的高糖固体培养基打孔（直径0.6 cm），注入发酵液粗提物和菌体粗提物，28℃培养48 h。设置平行实验3组，记录抑菌圈产生情况。

2 结果与分析

2.1 内生菌在骆驼蓬中的分布

分离培养后依照菌落特征形态初步排除重复，最终分离到72株骆驼蓬内生菌，其中内生细菌60株（见表1），内生放线菌12株（见表2）。

续表1

续表1

表2 骆驼蓬内生放线菌

内生菌在骆驼蓬植株的根、茎、果实中都有分布，其中茎内所分离得到的菌株数量明显高于根和果实。葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属菌株在根、茎、果实中均有分布，占内生菌总数的11.8%；类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的菌株仅在根中分离得到，13个菌属的菌株（如代尔夫特菌属、微小杆菌属、亮杆菌属等）仅在茎中分离得到，占76.5%。

2.2 不同培养基分离骆驼蓬内生菌效果

对于骆驼蓬内生细菌，牛肉膏蛋白胨培养基和YMA培养基的分离效果最好。牛肉膏蛋白胨培养基分离得到11株内生菌，其中葡萄球菌属4株，芽孢杆菌属2株，假单胞菌属（Pseudomonas）2株，内生芽孢杆菌1株，短波单胞菌属（Brevundimonas）1株，代尔夫特菌属1株；YMA培养基分离得到9株内生菌，其中芽孢杆菌属8株，刘志恒菌属（Zhihengliuella）1株。对于骆驼蓬内生放线菌，培养基分离效果为：TSB培养基＞YMA培养基＞MC培养基＞察氏培养基=NA培养基，分离效果较好的TSB培养基分离得到4株内生放线菌，为短状杆菌属（Brachybacterium）、链霉菌属与微杆菌属（Microbacterium）。

2.3 骆驼蓬内生菌多样性

将分离获得72的株内生菌提取基因组DNA，PCR扩增16S rDNA序列并测序，经序列比对，并构建进化树，显示骆驼蓬内生菌呈现较丰富的物种多样性（见图1）。骆驼蓬内生菌共分布于7个目15个科17个属共30种。其中细菌60株，分布在6个目10个科12个属22种，这12个属分别为葡萄球菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、短波单胞菌属、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、代尔夫特菌属、微小杆菌属、刘志恒菌属、根瘤菌属（Rhizobium）、农杆菌属、亮杆菌属。分离得到放线菌12株，分布在3个目5个科5个属8种，这5个属分别为链霉菌属(Streptomyces)、短状杆菌属、土地芽孢杆菌属（Terribacillus）、纤维菌属（Cellulosimicrobium）、微杆菌属。基于16S rDNA构建的系统发育树显示芽孢杆菌属为骆驼蓬内生菌的优势菌。

图1 基于骆驼蓬内生菌16S rDNA基因序列构建的neighbour-joining进化树

2.4 抑菌活性菌株筛选

以解淀粉欧文氏菌为靶标菌，对从骆驼蓬根、茎、果实中分离到的72株内生菌进行了抑菌活性的初筛与复筛，发现9株内生菌初筛对靶标菌具有抑制活性，阳性率为12.5%，分属于芽孢杆菌属（4株）、大洋芽孢杆菌属（1株）、微小杆菌属（1株）、链霉菌属（1株）、农杆菌属（1株）、亮杆菌属（1株）。复筛获得10株对靶标具有抑制活性菌株，阳性率为13.3%，复筛中抑菌活性较强的有6株（抑菌直径≥9 mm），其中芽孢杆菌属、亮杆菌属和链霉菌属为主，（见表3）。Bacillussp.82004-1抑菌活性最强，抑菌圈直径达到20 mm，（见图2）。

表3 骆驼蓬内生菌抑菌活性

图2 菌株82004-1对解淀粉欧文氏菌抑菌活性

3 讨论

本次研究共分离得到72株骆驼蓬内生菌，基于16S rDNA序列进行种类鉴定，共在17个属，其中芽孢杆菌为优势菌属。芽孢杆菌属是各种农作物及果树等经济作物中内生菌常见的属[14]，与本研究结果一致。沙漠环境中生长的骆驼蓬，其内生细菌仍以芽孢杆菌为主，表明在极端环境下芽孢杆菌广泛存在。因为芽孢杆菌在营养缺乏等不利条件下能够形成抗逆性强的芽孢，有利于在沙漠极端环境生存。

对于骆驼蓬的研究大部分集中在内生放线菌的分离，雷艳娟[15]分离得到的内生放线菌主要来源为根部，本研究结果表明骆驼蓬的内生菌主要集中于茎部，原因可能是本研究所分离得到的微生物主要为细菌，放线菌相对较少，而内生细菌与放线菌的分布在骆驼蓬植株的根与茎中有所差别，表明内生菌在植株各组织的分布存在特异性。推测其原因，可能与不同种类内生菌进入植物的方式相关，或与植物各组织为微生物生长提供的营养等方面相关。

YMA培养基分离效果较好，分离的菌株主要为芽孢杆菌属，可能与培养基提供的营养成分和微生物长期所处的环境营养水平相关。由于骆驼蓬植株处于特殊的沙漠环境，处于骆驼蓬植株内的芽孢杆菌属从骆驼蓬内所获取的营养成分有限，而YMA培养基相对于其它培养基营养物质含量较少，因此在骆驼蓬内的芽孢杆菌属内生菌更适合在YMA培养基所提供的低营养环境下生长。因YMA培养基中含有甘露醇，该物质适合较为复杂的细菌培养[16]，所以从YMA培养基上也分离得到一株刘志恒菌属内生菌。

研究表明解淀粉欧文氏菌生长繁殖速度快，常用的农用抗生素对其引起的病害防治效果有限[17]。本研究筛选获得的抑菌活性菌株主要分布在芽孢杆菌属，芽孢杆菌是一类能抵抗不良环境，且大多数可产生活性次生代谢产物的菌属[18-20]。有研究表明芽孢杆菌能产生多种蛋白类和脂肽类抗菌活性物质，具有较好的抑菌活性[21-23]。牛世全等[24]人在对多种细菌进行抑菌活性检测时，筛选获得一株抑菌活性强、抗菌谱广的芽孢杆菌B.subtilis 7-2-3-4，对轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌等8种植物病原菌的抑菌活性均在63.5%以上。本研究筛选获得一株强抑菌活性的类芽孢杆菌82004-1，可进一步探索其活性代谢产物，结合其培养周期短，代谢产物稳定等性质，可尝试规模化发酵生产，开发生防菌剂，应用于果树枝枯病的防治。

4 结论

从塔克拉玛干沙漠西缘骆驼蓬中共获得72株细菌，分布于7个目，15个科、17个属，展现出丰富的多样性，其中优势菌为芽孢杆菌属。骆驼蓬内生细菌主要分布于茎中，低营养的YMA培养基适用于骆驼蓬芽孢杆菌属内生菌的分离培养，牛肉膏蛋白胨培养基适用于多种骆驼蓬内生菌的分离培养，在骆驼蓬内生细菌中芽孢杆菌属对解淀粉欧文氏菌的抑制性较强。

近年来研究人员对于药用植物内生菌的研究逐渐深入，药用植物内生菌产生的代谢产物不仅可以提高宿主植物对于病害的抵抗力，也可以合成抗虫、抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性物质。但是在极端环境下的内生菌及其活性研究较少，骆驼蓬生活于塔里木盆地塔克拉玛干沙漠，极端干旱且营养物质稀少，并且具有一定的药用价值，因此，骆驼蓬及其内生菌值得进一步深入研究。