苦参碱对番茄根际土壤微生态的影响

华羚淇 ，宁静，曾红*

（1塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

果类蔬菜中的番茄（Lycopersicon esculeutumMill），不仅外形美观，味道鲜美，而且富含多种维生素、矿物质和酚类化合物，是良好的保健食品，对疾病也有一定的预防功效，具有很高的商品、风味与营养价值，已经成为人们生活中必不可少的蔬菜之一，有广阔的市场前景。近年来，番茄的种植面积在不断增加，但其优质化进程严重制约着我国农产品价值的进一步提升，而通过合理的施肥等方法来改善番茄的品质是目前研究的重点之一。

糖的含量是影响番茄果实风味品质的重要指标，也是消费者评判番茄好坏的重要标准。番茄果实中糖分含量的多少与番茄光合物质合成、运转和代谢密切相关。植物光合产物运转的主要形式是蔗糖，其首先由叶片等“源”器官经光合作用产生，经过一系列复杂的运输过程，最终进入果实，在果实内还会进行一系列的生化反应，最终形成果实内的总糖。因此叶绿素的含量与果实的糖分累积密切相关，合理地施用肥料对番茄果实的糖含量有着至关重要的影响。

苦豆子是中国西北地区常见的植物，广泛分布于新疆地区，当地种植者在种植作物如甜瓜、西瓜时，常将苦豆子地上部分作为绿肥施用于作物根际，实现果实增甜的效果。苦豆子含有多种生物碱，苦参碱是其主要成分之一。在过往农业相关研究中，发现苦参碱具有杀蚜活性，经苦参碱处理后的豆蚜代谢酶系受到显著影响，且苦参碱干扰了虫体对碱的代谢[1]；在针对亚洲柑橘木虱的实验中，苦参碱表现出对木虱发现和选择寄主能力的干扰效果，有效减少了柑橘植株所受侵害[2]。而在番茄植株的研究中，苦参碱的施用提高了番茄第一穗果实的单果重量，表现出良好的应用潜力[3]。

基于以上考虑，本试验研究在生长期、花期和果实成熟时期苦参碱对番茄叶片叶绿素含量的影响，并从植物根际土壤理化性质、酶活性及根际微生物群落结构等角度对番茄在根际微生态层面的动态变化进行分析，以期为番茄增甜种植提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

番茄：品种为紫玉，种子购自山东寿光种业有限公司。苦参碱：纯度＞95%，由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室提供。

1.2 实验方法

2020年，在新疆阿拉尔市塔里木大学塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室植物组织培养室（40°32′46″N，81°17′20″E）进行了盆栽试验。实验设空白对照组（CK）、苦参碱处理组（0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL）。2020年9月2日，开始育种，12月25日进入花期，花期进行人工授粉；2021年1月5日坐果。所有的实验地点均没有使用化肥和除草剂等化学药剂。在植株进入生长期，于12月2日后，开始分组处理。将对照组和实验组分别用清水和苦参碱进行灌根处理。灌根法：将清水或不同浓度的苦参碱10 mL分别加入相应处理组的番茄植物根部。每隔7 d加一次样，共加3次。1.2.1 土壤样品的采集

分别于2020年12月2日（生长期）、2020年12月30日（花期）和2021年1月7日（坐果后）采集根际土壤样品。用力晃动番茄植株根部，以除去根周围的松散土壤，再用小刷子小心地收集黏附在根部表面的土壤，以获得根际土壤。使用混样法，每个分组随机选取三个平行样品，并混合样品。采样后立刻将根际土壤样本放入冰盒，并迅速转运至实验室，通过60目筛除去植物残余和土壤动物。每个样品分为两部分：一部分在-80℃下保存，用于测定微生物群落多样性；另一部分室温风干以测定土壤理化性质和酶活性。

1.2.2 番茄根际土壤酶活性和理化性质的测定

采用碳酸氢钠法测定土壤有效磷（available phosphorus，AP）含量，将0.5 mol/L NaHCO3溶液以1：20的比例在25°C下以180 r/min振荡30 min，从土壤样品中提取土壤有效磷，通过定性脱磷滤纸过滤提取液并使用钼锑抗比色法分析有效磷含量[4]；使用火焰分光光度法测定土壤样品中钾离子（total K+，TK）的含量，将1 mol/L CH3COONH4以1：10的土壤溶液比从样品中提取土壤钾离子，样品在20°C下以180 r/min振荡30 min，提取液通过定性滤纸过滤，并使用火焰光度计（philes，中国南京）分析钾含量。土壤样品的氮（total nitrogen，TN）含量使用从苏州科铭生物技术有限公司（中国）购买的商业试剂盒测定，测定方法为凯氏法，先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化为铵态氮，将样品用浓硫酸消煮，使有机氮分解为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，分析土壤全氮含量。

土壤酶活性试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司（中国）。以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶（alkaline protease，ALPT）活性。以酚酞磷酸盐为底物测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性。用靛酚蓝比色法测定脲酶（urease，UE）活性。在好氧条件下，以单酚和双酚氧化制醌为基础，测定了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性。用比色法测定蔗糖酶（sucrase，SC）活性。H2O2在 240 nm 下有特征吸收峰，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下吸光度的变化，即可反应过氧化氢酶（catalase，CAT）活性的高低。

1.2.3 根际微生物多样性

用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取基因组DNA。随后，使用量子荧光计和纳米滴分光光度计测定DNA浓度、质量和完整性。使用TruSeq DNA样品制备试剂盒和模板制备试剂盒生成测序文库。基因组测序由个人生物技术公司（中国上海）使用Pacific Biosciences平台和Illumina MiSeq平台进行。

序列数据分析主要使用QIIME和R软件包（v3.3.0）进行。用qime中的OTU表对OTU水平的a多样性指数进行计算，如Chao1丰富度估计器、ACE度量（丰度覆盖估计器）、Shannon多样性指数和Simpson指数。生成OTU水平排序丰度曲线，比较样品间OTU的丰富度和均匀度。利用UniFrac距离度量[5-6]和主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）进行β多样性分析，以研究样本间微生物群落的结构变化，非度量多维标度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和算术平均无权对群方法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）分层聚类[7]。使用Student t检验和1000个排列的蒙特卡罗排列检验确定组间成对比较的Unifrac距离差异，并通过方框图和胡须图进行可视化。主成分分析（principal components analysis，PCA）也根据属级成分剖面进行[7]。使用排列多变量方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）[8]、相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）[9-10]和R软件包“vegan”评估各组间微生物群结构分化的显著性。使用MEGAN[11]和GraPhlAn[12]对分类组成和丰度进行可视化。基于样品/组间OTU的发生率（无论其相对丰度如何），使用R软件包“VennDiagram”生成了Venn图，以可视化样品或组间共享和独特的OTU[13]。

在门、纲、目、科、属和种水平上的分类单元丰度通过Metastats在样本或组之间进行统计比较[14]。使用默认参数的线性判别分析效应大小（LEfSe）分析检测组间差异丰富的分类群[15]。利用PLS-DA中R软件包“混合组学”的“plsda”功能揭示组间微生物群的变化[16]。随机森林分析应用于区分来自不同群体的样本，使用 R 软件包“randomForest”分析[17-18]。采用10倍交叉验证法估计泛化误差，预期的“基线”误差也包括在内。通过计算优势类群之间的Spearman秩相关进行共现分析。使用Cytoscape将|RHO|＞0.6和P＜0.01的相关性可视化为共现网络[19]。微生物功能由软件PICRUSt根据高质量序列进行预测[20]。

1.3 统计分析

本研究中单个样本的所有数据均表示为三个独立实验值的平均值±标准差。使用SPSS 18.0.0软件进行单因素方差分析，检验多组数据的平均值。P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为更显著性差异。

2 结果

2.1 苦参碱处理后番茄叶片的叶绿素含量及糖含量变化

如图1结果所示，在花期时，番茄叶片CK组的叶绿素含量为0.3560 mg/g，苦参碱浓度为0.0625 mg/mL的处理组的叶绿素含量为0.3682 mg/g，0.1250 mg/mL组的叶绿素含量为0.4935 mg/g，0.2500 mg/mL组的叶绿素含量为0.4329 mg/g。

坐果后，番茄叶片CK组的叶绿素含量为0.5284 mg/g，苦参碱浓度为0.0625 mg/mL的处理组的叶绿素含量为0.8059 mg/g，0.1250 mg/mL组的叶绿素含量为0.5017 mg/g，0.2500 mg/mL组的叶绿素含量为0.9432 mg/g。

图1 番茄叶片中的叶绿素含量

如图2结果所示，在花期时，番茄叶片CK组的叶片糖含量为3.8510 mg/g，苦参碱浓度为0.0625 mg/mL的处理组的叶片糖含量为3.9792 mg/g，0.1250 mg/mL组的叶片糖含量为1.3990 mg/g，0.2500 mg/mL组的叶片糖含量为2.7772 mg/g。

图2 番茄叶片中的可溶性糖含量

坐果后，番茄叶片CK组的叶片糖含量为1.1518 mg/g，苦参碱浓度为0.0625 mg/mL的处理组的叶片糖含量为5.4226 mg/g，0.1250 mg/mL组的叶片糖含量为3.6369 mg/g，0.2500 mg/mL组的叶片糖含量为1.5863 mg/g。

2.2 苦参碱处理后番茄植株根际土壤的理化性质与酶活性

如图3结果所示，在坐果后，施用苦参碱的处理组的根际土壤的氮含量显著高于空白对照组。

图3 番茄根际土壤理化性质

相比CK组，苦参碱处理后的番茄根际土壤的多酚氧化酶、脲酶的活性均有显著提高（如图4结果所示）。

图4 番茄根际土壤酶活性

2.3 施用苦参碱对番茄根际微生物群落结构的影响

2.3.1 微生物群落的α多样性的影响

通过测序从根际细菌群落获得平均130249个原始序列；使用DADA2方法处理这些序列。剔除低质量序列后共获得109302个序列，去噪后获得101313个有效序列，拼接后获得61308个序列，剔除嵌合体后获得51250个高质量序列，去除singleton后，最后获得48263个序列。

对根际真菌群落进行测序，平均获得139625个原始序列。剔除低质量序列后共获得118459个序列，去噪后获得117714个有效序列，拼接后获得116145个序列，剔除嵌合体序列后获得112799个高质量序列，剔除单基因序列后获得112799个序列。

对于番茄根际细菌群落的α多样性，在苦参碱处理后番茄植株根际细菌群落的Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数显著高于CK组，表明施用苦参碱后根际细菌群落的丰富度和多样性有明显提升（图5）。

图5 番茄植物根际细菌α多样性分析

对于番茄根际真菌群落的α多样性，在苦参碱处理后番茄植株根际真菌群落的Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Simpson指数高于CK组，表明施用苦参碱后，根际真菌群落的丰富度和多样性增加（图6）。

图6 番茄植物根际真菌α多样性分析

丰度曲线根据每个样品/组的丰度大小沿横坐标排列操作分类单位（OTU），并将其各自的丰度值作为纵坐标。各OTU之间以折线或曲线连接，反映了OTU丰度在各样品中的分布规律。对于微生物群落样品，该曲线能直观地反映群落中稀有OTU的高丰度和数量（图7）。施用苦参碱的处理组的等级普遍高于对照组，这表明苦参碱处理组群落中高丰度和稀有OTU的数量高于对照组。

图7 根际微生物群落的丰度曲线

2.3.2 主坐标分析（PCoA）和非度量多维标度分析（NMDS）

NMDS用于评估经苦参碱处理的番茄植株根际的微生物群落结构。在番茄开花期，细菌群落结构如图8（a）所示；应力为0.0349。真菌群落结构如图8（b）所示；应力为0.0554。细菌和真菌NMDS图中的应力值均小于0.2，说明数据是有效的。采用PCoA法对番茄根际微生物群落功能进行了评价。番茄根际细菌群落功能的PCoA如图8（c）所示，其中用PCo1和PCo2解释的百分比分别为71.6%和14.4%。图8（d）显示了番茄根际真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解释的方差百分比分别为52.0%和21.5%。

图8 开花期番茄根际微生物群落的NMDS分析和功能单元的PCoA分析

在番茄果实成熟期，细菌群落结构如图9（a）所示；应力为0.0334。真菌群落结构如图9（b）所示；应力为0.0783。细菌和真菌NMDS图中的应力值均小于0.2，说明数据是有效的。采用PCoA法对甜瓜根际微生物群落功能进行了评价。番茄根际细菌群落功能的PCoA如图9（c）所示，其中用PCo1和PCo2解释的百分比分别为73.5%和15.5%。图9（d）显示了番茄根际真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解释的方差百分比分别为83.4%和9.4%。

图9 成熟期番茄根际微生物群落的NMDS分析和功能单元的PCoA分析

2.3.3 冗余分析

以番茄叶片的叶绿素含量为指标，以番茄在各生育时期根际土壤理化性质、土壤酶活性和根际微生物优势菌群为因子，进行了冗余分析（redundancy analysis，RDA），以寻找与叶绿素含量存在相关性的因子。结果表明，在番茄开花期（图10）与果实成熟期（图11），根际细菌Aeromicrobium、Aliihoeflea、Blastococcus、Lysobacter、Nocardioides、Pelagibacterium和Salinimicrobium的相对丰度与叶片的叶绿素含量呈正相关。对于真菌，Acaulium的相对丰度与含糖量呈正相关。土壤理化性质如氮含量和有效钾含量与叶绿素含量呈正相关，土壤酶活性如多酚氧化酶、过氧化氢酶、碱性蛋白酶、碱性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性均与叶绿素含量呈正相关。

图10 开花期根际样品叶绿素含量、土壤酶活性、理化性质和优势微生物属的RDA分析

3 讨论

叶绿素含量是评价植株生理的重要指标。在番茄花期，施用苦参碱浓度为0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的处理组的植株叶绿素含量分别比对照组高3.41%、38.60%、21.58%；在成熟期，苦参碱0.0625 mg/mL和0.2500 mg/mL组的叶绿素含量分别比对照组高52.53%、78.52%这表明施用苦参碱可以有效地提高番茄叶片的叶绿素含量。

在施用苦参碱后，番茄根际土壤酶如多酚氧化酶、脲酶和蔗糖酶的活性均有显著提升，说明植物吸收营养素及抗逆的能力得到了提升。

施用苦参碱后，番茄根际微生物群落结构发生变化。NMDS图显示，苦参碱处理组与对照组的距离较远，说明苦参碱处理组和CK组的微生物群落结构存在显著差异。此外苦参碱0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的处理组与CK组的距离依次增大，表明群落结构的改变程度与苦参碱的浓度及用量呈正相关。

功能单元PCoA图显示苦参碱处理组与CK组的距离较远，说明苦参碱处理组与CK组的微生物群落功能存在显著差异。此外苦参碱0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL处理组与CK组的距离依次增大，表明群落功能的改变程度与苦参碱的浓度及用量呈正相关。这些结果表明，苦参碱可以改变番茄根际微生物群落结构和功能。

通过对比属分类学水平下，处理组中相对丰度显著高于对照组的细菌种群，与RDA分析中与番茄叶片叶绿素含量呈正相关的细菌种群，发现Aeromicrobium、Altererythrobacter、Erythrobacter、Hyphomicrobium、Pedomicrobium、Steroidobacter、Streptomyces和Lysobacter是番茄花期（t2）与番茄叶片叶绿素含量呈正相关的相对丰度显著上升的细菌；而Ilumatobacter、Nocardioides和Lysobacter是番茄成熟期（t3）与番茄叶片叶绿素含量呈正相关的相对丰度显著上升的细菌。

同样的，通过对比属分类学水平下，处理组中相对丰度显著高于对照组的真菌种群，与RDA分析中番茄叶片叶绿素含量呈正相关的真菌种群，发现Arthrographis、Byssochlamys、Exophiala、Lophotrichus、Microascus、Paecilomyces、Petriella、Pleurostoma、Scedosporium和Schizophyllum是番茄花期与番茄叶片叶绿素含量呈正相关的相对丰度显著上升的真菌；而Preussia和Talaromyces是番茄成熟期与番茄叶片叶绿素含量呈正相关的相对丰度显著上升的真菌。

4 结论

在番茄的盆栽实验中验证了苦参碱的效果，施用苦参碱后番茄叶片的叶绿素含量有较显著提升，并改变了番茄根际的微生物群落结构，如Streptomyces和Lysobacter等有益菌种丰度显著提升，改善了植株根际的微生态，促进植株的生长，具有良好的应用前景。