黄色链霉菌TRM45540遗传转化系统的构建

夏影影，张巧燕，邢利，陈乙煌，黄建军，罗晓霞*

（1塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔843300）

（2塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（3新疆阿拉尔市十三团农业发展服务中心，新疆 阿拉尔 843300）

黄色链霉菌TRM45540是一株分离自新疆罗布泊土壤的高产放线菌素D的链霉菌新物种[1]，因其能够在ISP系列培养基和高氏培养基上生长并产生黄色色素，故命名为黄色链霉菌[2]。在前期研究中发现该菌株具有良好的抗逆性，并且对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、棉花枯、黄萎病菌和核桃腐霉菌等多种动、植物病原菌都具有较好的抑制活性，同时，基于基因组学研究发现其基因组上蕴藏着丰富的次级代谢产物生物合成基因簇[3-5]。由此可见，黄色链霉菌TRM45540具有较强的代谢潜力，值得深入研究。

在研究链霉菌抗生素生物合成机制及抗逆机制并对其进行分子遗传学和基因工程操作时，通常要对抗生素基因簇及抗逆基因簇中的单个基因功能分别进行分析和验证，在此过程中需要将被研究的基因在天然宿主中进行突变，并使其返回到天然的宿主中去回补表达，这就要求建立所研究菌株自身的遗传操作系统。就链霉菌而言，科研人员多采用转化、转导和接合转移等方法研究菌株的遗传操作系统[6]。其中接合转移法由于受宿主限制修饰系统的干扰较少，能够高效转移外源DNA，并且该方法还具备简单、高效、宿主范围广等特点，因此在链霉菌遗传操作中应用十分广泛[7]。为了深入研究黄色链霉菌TRM45540的功能活性，本研究以整合型载体pSET152和自杀型载体pKC1139为出发质粒，ET12567(pUZ8002)为供体菌，TRM45540为受体菌，通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移方法建立了TRM45540遗传转化系统。该体系的建立为进一步研究TRM45540菌株的功能基因簇和其他遗传操作提供必不可少的平台，也为研究其抗生素合成代谢途径、调控机理、遗传改良等奠定重要的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

受体菌黄色链霉菌（Streptomyces lutues）TRM45540由本实验室分离鉴定。供体菌大肠杆菌E.colipUZ8002/ET12567和pKC1139/DH5α由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

大肠杆菌培养基以LB液体和固体培养基，链霉菌固体培养基为高氏一号、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY和YD培养基；链霉菌液体培养基为TSB和2*YT培养基，上述培养基的配制参照链霉菌遗传操作手册[13]。

1.1.3 主要仪器和试剂

凝胶成像系统：美国BIO-RAD；高速离心机：德国Eppendorf；电泳仪：DYCZ-26C；安普霉素、卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素和硫链丝菌素等多种抗生素购自Sigama公司，基础生化试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 黄色链霉菌TRM45540最适产孢培养基的筛选

收集黄色链霉菌TRM45540孢子，溶于20%甘油中制成孢子悬液，然后分别取100 μL孢子悬液涂布在不同固体培养基(高氏一号、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY、YD培养基)并置于37℃培养箱培养，每种培养基设置三个平行，观察其生长情况并计数。

1.2.2 黄色链霉菌TRM45540抗生素敏感性测定

将安普霉素(apramycin,APR)、卡那霉素(kanamycin,KAN)、氯霉素(chloramphenicol,CHL)、氨苄青霉素 (ampicillin,AMP)和硫链丝菌素 (thiostrepton,THIO)等多种抗生素分别配成实验室常用浓度，即50、100、50、25和 100 mg/L；取一定量加入到筛选到的黄色链霉菌TRM45540最适产孢培养平板上。取100 μL新鲜孢子涂布于各个抗生素的固体平板上，置于37℃培养箱中培养，观察其生长状况并记录。

1.2.3 黄色链霉菌TRM45540最适孢子萌发培养基及最适萌发时间的确定

分别取100 μL的孢子悬液置于50℃水浴锅中热激处理10 min后接种于2×YT与TSB液体培养基中进行预萌发，每隔半小时对未热激孢子与热激之后的孢子分别进行取样在相差显微镜下观察孢子萌发情况。

1.2.4 大肠杆菌-黄色链霉菌TRM45540接合转移培养基的筛选

吸取已经萌发的黄色链霉菌孢子悬液与大肠杆菌pUZ8002/ET12567以1:2的比例混合后分别涂布至MS、Modified-ISP4、2CM营养平板上，37℃培养箱中培养16～18 h后，涂布合适的抗生素及萘啶酮酸，培养5 d后观察菌株生长情况。

1.2.5 接合转移子的PCR验证

以接合转移子的总DNA为模板，以APR抗性筛选基因为目标序列设计引物，通过PCR验证接合子。引物序列为：Apr-F：5’-ATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAAT-3’；Apr-R：5’-TGGCGAGCGGCATCGCATTCTT-3’。

2 结果与分析

2.1 黄色链霉菌TRM45540菌株的最适产孢培养基筛选

作为接合转移的受体菌，链霉菌的孢子的质量直接决定接合转移是否能够成功。为了获得足量的新鲜链霉菌孢子，本实验将100 μL黄色链霉菌孢子悬液分别涂布至高氏一号、2CM、Modified-ISP-4、MS、Oatmeal、PDA、GYM、MM、GSY和YD培养基后，在37℃培养，每隔12小时记录平板上生长菌落的个数，结果表明TRM45540菌株的在培养基上菌落数最多，其次是MS培养基、GYM培养基、GSY培养基、Gause’培养基和PDA培养基上的菌落数也较多，（图1）为不同培养基上菌株的生长量状况，但根据菌体生长速度及产孢量来看，MS培养基的生长速度最快，因此以MS培养基为最适产孢培养基。

图1 黄色链霉菌TRM45540在不同培养基上的生长状况

2.2 黄色链霉菌TRM45540抗生素敏感性测定结果

遗传操作系统的建立需要适当的筛选标记，为此本研究检测了黄色链霉菌(Streptomyces lutues)TRM45540对各种抗生素的耐药性实验，结果表明：黄色链霉菌TRM45540对APR、THIO和KAN抗生素敏感，对AMP和CHL抗生素具有一定的耐药性（表1），后期在进行遗传转化时可以选用APR、THIO和KAN作为抗性筛选标记。

表1 黄色链霉菌TRM45540不同抗生素的敏感性

2.3 大肠杆菌-黄色链霉菌属间接合转移最适萌发培养基与最适萌发时间筛选

接合转移在放线菌孢子萌发的早期发生，因此在进行大肠杆菌-放线菌属间接合转移实验中，有必要探索菌株孢子萌发适宜的状态。本实验将孢子悬液经50℃热处理后接种至2×YT与TSB液体培养基中进行预萌发，每隔半小时取样通过相差显微镜观察孢子萌发情况，以未经热激处理的孢子悬液作对照。发现在TSB液体培养基中的孢子在2小时可以观察到孢子萌发，而2×YT培养基在2小时仅观察到少量孢子萌发。在2×YT培养基和TSB培养基中培养4小时后，均可以观察到菌体萌发形成菌丝体小团，TSB培养基形成的菌丝体小团多于2×YT培养基（图2中第4行，5列）。结果表明TSB培养基为大肠杆菌-黄色链霉菌属间接合转移最适培养基，最适萌发时间为4 h。

图2 黄色链霉菌TRM45540孢子萌发状态

2.4 大肠杆菌-黄色链霉菌属间接合转移最适培养基筛选

进行属间接合转移时，培养基是否合适对于实验的成功与否有着决定性的影响。本实验以大肠杆菌 ET12567(pUZ8002+pKC1139)和 ET12567(pUZ8002+pSET152)作为供体菌，以黄色链霉菌TRM45540(Streptomyces lutues)作为受体菌，采用MS、Modified-ISP4和2CM培养基检测大肠杆菌-黄色链霉菌菌株属间接合转移阳性率（表2），结果发现MS培养基生长的接合子阳性率达80.2%，明显高于另外两种培养基，因此更适合作为接合子生长培养基。

表2 接合转移培养基的确定

2.5 接合转移子检测

将接合转移子接种到含APR抗生素的TSB固体培养基上培养，培养2～3天后挑取一个单菌落进行培养。接下来，以接合子的总DNA为模板，以APR抗性筛选基因为目标序列设计引物，通过PCR验证接合子。在相同条件下，以pKC1139和pSET152质粒DNA为阳性对照模板，以TRM45540总DNA为阴性对照模板，同时进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测发现接合子中能扩增出与质粒pKC1139和pSET152大小一致的条带（图3（a），Lane 1，2；图3（b），Lane 1，2），说明该质粒已被成功转入到黄色链霉菌TRM45540中。

图3 接合转移子的PCR验证

3 讨论与结论

链霉菌是一类极其重要的资源，能产生多种次级代谢产物，这些产物大都具有良好的生物活性，除了发挥常规的杀菌、抑菌、抗感染等作用外还具有抗高血压、高胆固醇性及免疫抑制性等，在人类的社会生活中扮演着十分重要的角色，因而挖掘链霉菌中的次级代谢产物具有十分重要的意义[8-12]。黄色链霉菌TRM45540是一株分离自罗布泊土壤的嗜盐链霉菌，具有很强的生物活性及代谢潜力[3]，要想充分研究TRM45540菌株的功能基因簇的活性，通常要采用基因中断、基因敲除、异源表达和超量表达等方法从基因角度对其活性代谢产物进行充分挖掘，因此构建一个高效率的遗传操作系统对其目标产物生物合成基因簇及其基因簇上的功能基因的研究非常重要。本研究为了能够更全面地建立菌株TRM45540天然产物生物合成基因簇的基因操作方法，选用自杀型载体pKC1139和整合型载体pSET152分别构建了应用于基因的突变和回补的接合转移质粒，优化了影响黄色链霉素TRM45540接合转移的主要因素，通过分析菌株TRM45540的最适产孢培养基、抗生素敏感性、孢子的最适萌发培养基、萌发时间以及接合转移培养基，建立了大肠杆菌ET12567(pUZ8002)黄色链霉菌TRM45540属间接合转移体系：通过MS培养基培养收集孢子，将收集的孢子50℃热激10 min后，37℃萌发4 h后，与供体菌ET12567(pUZ8002)在MS培养基上进行接合转移，接合转移的抗性筛选标记可以采用APR抗性、THIO抗性和KAN抗性。在此条件下，成功将质粒pKC1139和pSET152接合转移进TRM45540菌株中。这为验证TRM45540活性代谢产物基因簇的合成机制及功能奠定了遗传基础，也为接下来在此基础上对该菌株进行基因工程操作和深入研究提供了良好的技术支撑。