黄芪和力智能低温高效提取技术过程控制的指纹图谱研究

苏雨苗，宋力飞，刘常青，陈丽宜

（1.广州泽力医药科技有限公司，广东广州 510700；2.广州中泽生物技术有限公司，广东广州 510700）

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membra‐naceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根和根头，晒干。性甘，微温，归肺、脾经，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌的功效，用于气虚乏力、食少便澹、中气下陷、久泻脱肛等[1]。

中药材资源是中医药的物质基础，其质量事关临床用药的安全性与有效性，但目前中药材的种子、种苗、种植、采收加工、饮片炮制等相关技术规范及质量控制标准尚不完善，如何科学评价是中药产业现代化、标准化以及国际化的前提条件[2-3]。近年来，中药指纹图谱的应用极大地促进了基于药效成分评价中药材质量的科学性及相应有效成分群的发现，应用现代仪器分析手段和方法研究分析中药的质量和药效，对保证临床用药的安全性和有效性具有重要的指导意义[4-6]。与现代分析技术相结合的中药指纹图谱，用能体现中药药效物质基础的化学物质群来综合评价中药质量，符合中医药理论，是国内外认可的中药质量控制的有效手段[7-8]。

本研究采用和力智能低温高效提取技术（HHLSE）对黄芪进行提取，并运用指纹图谱技术对黄芪提取工艺过程进行跟踪，通过比对原材及不同中间品之间物质群的转移情况，能更好地实现对提取过程的质量控制及评价，为中药产业现代化发展提供理论依据和技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

和力智能低温高效提取成套设备（广州泽力医药科技有限公司）；LC-10AT VP PLUS高效液相色谱仪（岛津）；TB-114电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 试药

黄芪（批号：T20210301）采购自天一药业有限公司，经本公司宋力飞高级工程师依据2020年版《中国药典》检验为合格品；芒柄花素对照品（批号201906，质量分数≥98%，北京仪化通标科技有限公司）；甲醇（分析纯，批号20201022，天津市富宇精细化工有限公司）；乙腈（色谱纯，批号R141915，北京迪科马科技有限公司）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号202008，质量分数≥98%，中国食品与药品检定研究院）；磷酸（分析纯，批号20200105，天津市富宇精细化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 黄芪原材的HHLSE提取

取黄芪原材20 kg，粉碎后进行HHLSE提取、分离、浓缩、精制，提取过程中对系列中间产品进行取样。

2.2 对照品溶液制备

精密称取芒柄花素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷3 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为0.3 mg/mL的溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取黄芪药材粉末及各个中间品约6 g，精密称定，加入60 mL甲醇超声40 min，滤过，残渣用40 mL甲醇超声20 min，合并滤液，挥发至近干（65℃），残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，静置4 h，微孔滤膜滤过，即得。

2.4 色谱条件

通过UV检测器对200~400 nm段进行全波长扫描，得到254 nm出峰数量较多，信号响应值大，基线平稳，故而选用254 nm为黄芪指纹图谱的检测波长；色谱柱为Diamonsil C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水（pH=2.62）为流动相B，梯度洗脱（0~17 min，8%→19%B；18~30 min，19%→21%B；31~35 min，21%→23%B；36~45 min，23%→25%B；46~50 min，25%→28%B；51~60 min，28%→45%B；61~70 min，45%→56%B）。

黄芪原材指纹图谱如图1所示，可见，黄芪原材药粉的色谱峰面积较大且分离度较好的有10个色谱峰，可作为黄芪指纹图谱的共有峰。其中，3号峰经检测确定为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰经检测确定为芒柄花素。

图1 黄芪原材指纹图谱Figure 1 Fingerprint of raw material of A.membranaceus

2.5 黄芪指纹图谱方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取同一批黄芪原材的供试品溶液15 μL，按照“2.4”项色谱条件重复进样6次，记录色谱图。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价。结果各共有峰的相对保留时间RSD值均在2%以下，相对峰面积RSD值在5%以下，色谱图相似度达到0.950以上，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批黄芪药粉6份，分别按照“2.3”项方法制备供试品溶液，按照“2.4”项色谱条件测定，记录色谱图。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价。结果10个共有峰的相对保留时间RSD值均在2%以下，相对峰面积RSD值在5%以下，色谱图相似度达到0.950以上，表明方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一批黄芪原材的供试品溶液15 μL，分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样，按照“2.4”项色谱条件测定，记录色谱图。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价。结果各共有峰的相对保留时间RSD值均在2%以下，相对峰面积RSD值在5%以下，色谱图相似度达到0.950以上，表明供试品溶液在常温下放置24 h内稳定。

2.6 黄芪提取过程各中间品指纹图谱的测定

分别取“2.2”项对照品溶液，黄芪原材药粉、HHLSE提取工艺过程的提取液、离心液、三足离心渣、高速离心渣、微滤浓液、微滤清液、膜浓液、膜洗液及膜清液，精密称定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，分别按“2.4”项色谱条件测定，记录色谱图，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”计算各中间品指纹图谱的相似度，结果见表1、图2。

图2 黄芪提取各中间品指纹图谱对比Figure 2 Comparison of fingerprints of the intermediate products extracted from A.membranaceus

表1 黄芪提取过程各中间品指纹图谱相似度对比Table 1 Comparison of the similarity of fingerprints of each intermediate product in the extraction process of A.membranaceus

可见，黄芪原材及不同中间品的指纹图谱色谱行为不尽相同。其中，膜浓液、膜洗液与黄芪原材相似度均在0.950以上，提取液、离心液、三足离心渣、高速离心渣、微滤浓液、微滤清液及膜清液与黄芪相似度则在0.900以下，表明黄芪HHLSE提取过程中，物质群在不同的工艺阶段变化是不一致的，膜浓液、膜清液的相似度分别为0.955、0.431；通过不同工序的指纹图谱比较，可以直观地看到大多数物质群富集于黄芪膜浓液、膜洗液中。

3 讨论

本研究考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈-0.1%磷酸水系统，结果表明乙腈-0.1%磷酸水系统作为流动相，峰形较好，基线平稳，出峰数量多，分离度较高，因此确定以乙腈-0.1%磷酸水作为流动相系统。通过UV检测器对200~400 nm段进行全波长扫描，得到254 nm波长下出峰数量较多，信号响应值大，基线平稳，故254 nm可作为黄芪指纹图谱的检测波长。此外，还对流动相梯度进行了比较优化，最终确定为“2.4”项的色谱条件，该方法重现性、稳定性良好。黄芪的10个共有峰中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷所占峰面积最大，具有明显特征，故而选择为参照峰。

HHLSE提取工艺是在室温下对物料进行提取，能很好地保留原药材的物质成分及风味，使得最终产物能很好地保留物料的原特征[9-10]。黄芪HHLSE提取过程中，经过粉碎、提取、分离、精制、浓缩等相应工序，黄芪原材及不同中间品的指纹图谱色谱行为不尽相同。其中，膜浓液、膜洗液与黄芪原材相似度均在0.950以上，膜浓缩液经过精制、浓缩等工艺，有效成分得以富集，保留了原材的物质成分及风味；提取液、离心液、三足离心渣、高速离心渣、微滤浓液、微滤清液及膜清液与黄芪相似度则在0.900以下。黄芪提取液由于加纯水提取稀释，物质群与原材相较有一定差异。通过不同工序的指纹图谱比较，可以直观地观察到物质群在不同的工艺阶段变化是不一致的，大多数物质群最终富集于黄芪膜脓液、膜洗液中。

本研究以指纹图谱为技术手段，对黄芪的HHLSE提取工艺过程进行研究，可以直观地观察到物质群各个工艺阶段的转移过程，从而对提取过程进行监控，为黄芪提取过程的质量控制及评价提供技术支持，为中药产业现代化发展及新型提取工艺研究提供理论依据及技术支持。