白细胞介素-35介导p38 MAPK/NF-κB信号对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用

谢亚玲，刘佳丽，杨丽，陈苗苗

（1.绵阳市中心医院重症医学科，四川绵阳 621000；2.西南医科大学附属医院重症医学科，四川泸州 646000）

急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是指由严重感染、外伤等原因引起的肺组织内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质的弥漫性损伤[1-2]。白细胞介素-35（interleukin-35，IL-35）属于IL-12家族，是由IL-12 p35亚基和EB病毒诱导基因3（epstein-Barr virus inducible gene 3，Ebi3）亚 基 组 成 的 异 二 聚 体[3]。Ebi3是IL-12 p40同源物，也是EB病毒在B淋巴母细胞中诱导产生的睫状节神经细胞营养因子[4]。IL-12 p35是一种糖蛋白，在人类大部分组织中表达[5]。免疫系统活化的树突状细胞、调节性T细胞和调节性B细胞中均具有Ebi3表达和分泌。有研究表明，IL-35主要由Treg细胞限制性分泌，对免疫功能发挥很强的负向调控。丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[6]。研究证实，MAPKs信号传导通路存在于大多数细胞内，参与细胞生长、分化及凋亡等生物学过程，MAPK主要成员为p38 MAPK，可调节肺部病变炎症反应、细胞凋亡[7-8]。核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）是调节细胞因子和炎性介质表达的重要转录因子，参与机体细胞凋亡和细胞分化、应激及组织损伤等过程中信息传递[9]。本研究旨在探讨IL-35介导p38MAPK/NF-κB信号通路对LPS诱导的ALI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级小鼠40只，6～8周龄，体质量22～25 g，购自西南医科大学，生产许可证号：SCXK（川）2018-17。小鼠饲养于SPF级屏障环境中，自由进食和饮水。所有动物实验经医院动物伦理委员会批准并进行。

1.2 试剂与仪器

小鼠肺上皮细胞MLE-12购于上海文韧生物科技有限公司；DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购于上海中乔新舟生物科技有限公司；空白的pcDNA3.1质粒、表达IL-35的pcDNA3.1质粒购自上海雅吉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaaa‐haricles,LPS）购于上海吉至生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；IL-12a/p35、EB病毒诱导蛋白3（Ebi3）和β-actin单克隆抗体购自上海泽叶生物科技有限公司；Ebi3、IL-35酶联免疫吸附（enzyme linked im‐munosorbent assay,ELISA）试剂盒购买自欣博盛生物科技公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin6，IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin1β,IL-1β）ELISA试剂盒购于上海将来实业股份有限公司；髓过氧化物酶（myelo‐peroxidase，MPO）试剂盒购于上海广锐生物科技有限公司；Trizol试剂盒购于北京天漠科技开发有限公司；RT-PCR反转录试剂盒购于北京智杰方远科技有限公司。

1.3 细胞培养及转染

将细胞MLE-12接种至含营养物质的RPMI-1640培养基中，置于37℃充满5%（φ）CO2培养箱中培养。当细胞覆盖率达80%时，用PBS清洗2次，胰蛋白酶进行消化，离心弃上清，更换培养基继续培养。根据Lipofectamine 2000说明书将pcDNA3.1-IL-35（pIL-35）质粒或pIL-35-NC质粒用转染至细胞中，转染48 h后收集各组细胞。

1.4 小鼠急性肺损伤模型制备及分组[10]

将40只小鼠随机分成4组，分别为对照组（转染pIL-35-NC质粒组）、LPS组、LPS+NC组、LPS+pIL-35组，每组10只。除对照组外，其余组小鼠采用3%（φ）戊巴比妥钠麻醉小鼠，暴露小鼠气管后，用注射器缓慢滴加LPS入气管内，竖立起小鼠，旋转，使LPS分布均匀，以水柱随呼吸上下浮动作为插管成功标志，即为建模成功。在成功建模后，对照组给予生理盐水气管内滴注。LPS+NC组：模型小鼠经尾静脉注射转染pcDNA3.1-NC空载质粒的MLE-12细胞。LPS+pIL-35组：模型小鼠经尾静脉注射转染pIL-35质粒的MLE-12细胞。

1.5 肺组织病理变化

取小鼠肺组织，使用4%（φ）多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，参照HE染色试剂盒及TUNEL染色试剂盒说明书的步骤进行染色5～15 min，常规清洗、脱水、封片，置于光学显微镜观察肺部组织学改变，显微镜下随机选择3～5个视野，于100倍拍照。

1.6 小鼠肺损伤评分

HE染色后观察肺组织病理学变化并行肺损伤评分，观察炎性细胞浸润、肺泡出血、肺水肿、肺泡间隔增宽或透明膜形成4项指标，根据肺损伤严重程度分别进行评分（0分：无病变；1分：轻度病变；2分：中度病变；3分：重度病变；4分：极重度病变），累计总分为小鼠肺损伤评分。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测

将肺组织样本搅碎匀浆，提取总RNA，逆转为cDNA后进行荧光定量PCR。PCR引物如下：IL-12a/p35（上 游：5′-CCTTGCACTTCTGAAGAGATTGA-3′，下游：5′-ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT-3′）；Ebi3（上游：5′-CAGAGCACATCATCAAGCC-3′，下游：5′-GAGAAGATCTCTGGGAAGGG-3′）；β-action设置为内参（上游：5′-GCAAGAGCACAAGAGG A AGA-3′，下游：5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3′）。采用2-∆∆Ct计算各基因相对表达量。

1.8 肺脏组织样本采集与处理

采集小鼠肺组织，用PBS冲洗干净，右肺中叶称湿质量（wet weight,W），然后在干燥箱中以80℃烘48 h，测定干质量（dryweight,D），以W/D评估肺组织的水肿程度。按照试剂盒说明方法进行测定MPO。

1.9 血清TNF-α、IL-6和IL-1β的检测

处死小鼠取血清，采用TNF-α、IL-6和IL-1βELISA试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，详细步骤遵照试剂盒说明书进行。

1.10 肺组织TNF-α、IL-6和IL-1β检测

取小鼠肺脏组织，加入预冷裂解液行研磨匀浆，以3 000 r/min转速离心10 min后取上清，−20℃冷藏，采用ELISA法检测肺脏组织TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.11 Western blot检测

取小鼠肺脏组织，将组织剪碎后加入RIPA强裂解液裂解，经过离心后测定上清液蛋白浓度。收集好蛋白样后进行凝胶电泳，过夜孵育一抗后，室温孵育荧光二抗1 h，用电化学发光法（ECL）于暗室发光。采用Image J软件分析蛋白条带。

1.12 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件分析数据。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠IL-35表达的影响

对照组细胞结构完整，无病理表现；LPS组出现肺泡腔变窄，细胞结构紊乱，细胞浸润在炎性环境等ALI病理表现。与对照组相比，LPS组IL-12a/p35和Ebi3相对mRNA表达量降低（P<0.05）。与LPS+NC组 相 比，LPS+pIL-35组IL-12a/p35和Ebi3相对mRNA表达量明显升高（P<0.05）；LPS组和LPS+NC组IL-12a/p35、Ebi3相对mRNA表达量差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot实验结果表明，与对照组相比，LPS组IL-12a/p35、Ebi3蛋白相对表达量明显降低（P<0.05）。与LPS+NC组相比，LPS+pIL-35组IL-12a/p35、Ebi3蛋白相对表达量明显增加（P<0.05）。LPS组和LPS+NC组IL-12a/p35、Ebi3蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1 pIL-35预处理后对ALI小鼠IL-35表达的影响Figure 1 Effect of pIL-35 pretreatment on the expression of IL-35 in ALI mice

2.2 各组小鼠肺脏组织病理观察及肺损伤评分

对照组肺脏组织肺泡结构清晰，细胞排列整齐，未见炎症细胞浸润，无病理性损伤；LPS组小鼠肺脏组织结构紊乱，肺泡壁增宽增厚，肺间质出现水肿，并伴有大量炎症细胞浸润；LPS+pIL-35组肺组织结构较清晰，肺泡壁较模型组更薄，接近对照组。与对照组相比，LPS组小鼠肺组织损伤评分升高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织损伤评分明显下降（P<0.05）。与对照组相比，LPS组小鼠肺组织W/D增大（P<0.05），出现肺水肿；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织W/D明显减小（P<0.05）。与对照组相比，LPS组MPO水平升高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组MPO水平降低（P<0.05）。见图2。

图2 各组小鼠肺脏组织病理观察Figure 2 Pathological observation of lung tissues of mice in each group

2.3 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠炎症因子水平比较

与对照组相比，LPS组小鼠血清炎症因子TNFα、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显下降（P<0.05）。与对照组相比，LPS组小鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显下降（P<0.05）。见图3。

图3 各组小鼠炎症因子水平Figure 3 Levels of inflammatory factors in mice in each group

2.4 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠肺组织凋亡的影响

与对照组相比，LPS组小鼠肺组织凋亡细胞比例明显增高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织凋亡细胞比例明显降低（P<0.05）。与对照组相比，LPS组Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平明显增加，Bcl-2蛋白表达水平明显减小（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平明显减少，Bcl-2蛋白表达水平明显增加（P<0.05）。见图4。

图4 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠肺组织凋亡的影响Figure 4 Effect of pIL-35 pretreatment on lung tissue apoptosis in mice with LPS-induced ALI

2.5 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠p38MAPK/NF-κB信号通路的影响

与对照组相比，LPS组小鼠肺组织p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表达明显升高（P<0.05）；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表达明显下降（P<0.05）；而各组间p38、p65、IκB蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P<0.05），见图5。

图5 pIL-35预处理后对LPS诱导的ALI小鼠p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响Figure 5 Effect of pIL-35 pretreatment on p38 MAPK/NF-κB pathway in mice with LPS-induced ALI

3 讨论

ALI是造成患者死亡的原因之一，主要的临床表现是呼吸衰竭和顽固性低氧血症[11-12]。ALI常见的发病机制是炎性细胞及其释放的细胞因子介导的炎症，可导致肺泡腔渗出液体，使肺微血管通透性增高，进一步导致非心源性肺水肿，严重影响患者的生活质量，威胁患者的生命健康[13-14]。

本研究结果显示，经pIL-35预处理后，LPS诱导的ALI小鼠肺脏组织病理损伤有所缓解。与对照组相比，LPS组IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相对表达量降低，经pIL-35预处理后，IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相对表达显著提升。与对照组相比，LPS组小鼠肺组织W/D增大，出现肺水肿；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织W/D明显减小，肺水肿症状有所缓解。与对照组相比，LPS组MPO水平升高；与LPS组相比，LPS+pIL-35组MPO水平降低。结果提示经pIL-35预处理后，缓解了LPS诱导的小鼠肺损伤，减低MPO的含量，缓解炎症反应。MPO是一种血红素蛋白，富含于中性粒细胞中，当机体受到外界刺激可释放MPO到组织液中[15]。MPO能催化氧化氯离子产生次氯酸杀死吞噬细胞中的微生物，破坏多种靶物质，在体内炎症的产生和调节中发挥作用[16-17]。有研究报道显示，酵母混悬液诱导小鼠急性肺损伤试验发现小鼠肺脏MPO活力显著增强[18]。

本研究结果发现，与对照组相比，LPS组小鼠血清和肺组织中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠血清和肺组织中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显下降（P<0.05）。结果提示经pIL-35预处理后，减轻了LPS诱导的ALI炎症反应。炎症因子的大量释放是ALI最重要的病理进程，在诱导肺损伤过程中发挥着重要作用。LPS作用于肺组织可诱导巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子。TNF-α可在炎症反应起始阶段诱导多种炎性因子大量释放，触发级联炎症反应，进而加重ALI患者机体炎症刺激[19]。既往研究[20]表明，IL-6、TNF-α和IL-1β炎症因子在LPS诱导的ALI小鼠中含量增加，经干预后其水平下降，这与本文研究结果一致。

本研究发现，与对照组相比，LPS组肺组织凋亡细胞比例、Bax和cleaved ca/cas3蛋白表达水平明显增高，Bcl-2蛋白表达水平明显减小；与LPS组相比，LPS+pIL-35组肺组织凋亡细胞比例、Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表达水平明显降低，Bcl-2蛋白表达水平明显升高。结果提示，经pIL-35预处理后抑制了LPS诱导的ALI小鼠肺组织细胞凋亡，从而起到保护肺脏器官的作用，其作用机制可能是通过抑制促凋亡蛋白Bax表达和促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达。Western blot实验结果显示，与对照组相比，LPS组小鼠肺组织p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表达明显升高；与LPS组相比，LPS+pIL-35组小鼠肺组织p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表达明显下降。该结果提示IL-35调节p38 MAPK/NF-κB通路抑制LPS诱导的急性肺损伤。p38 MAPK对机体炎症反应和正常免疫有重要影响，参加中性粒细胞及巨噬细胞等功能性反应，同时可对生成的微量干扰素进行调节以调控T细胞分化、凋亡[21]。LPS诱导后肺组织内p38 MAPK被激活，参加炎症反应与细胞应激、凋亡等多种生物学行为[22]。NF-κB为调控炎症关键环节，有启动炎症反应，表达黏附分子、介导单核细胞形成细胞因子等多种生物效应。NF-κB可加速释放炎症介质，刺激细胞释放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子加重机体炎症反应。既往研究［23］表明，泽漆醇提取物对LPS诱导小鼠ALI具有保护作用，其机制可能与调控MAPK/NF-κB信号通路有关，这与本文结果类似。

综上所述，IL-35通过调控p38 MAPK/NF-κB通路，降低LPS诱导ALI小鼠炎症反应程度，缓解病理损伤，抑制细胞凋亡，对受损肺组织起到保护作用。