基于UPLC-Q-TOF/MS技术的平喘颗粒化学成分分析

蒋鹏娜，李竹英，孙国东，霍金海

（1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨 150036；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

平喘颗粒来源于黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科临床常用经验方温阳平喘汤，在临床上应用已近50年。平喘颗粒由淫羊藿、炙麻黄、黄芪、太子参、五味子、款冬花、地龙、罂粟壳、知母等9味药组成，具有温阳益气、化痰平喘之功效，用于治疗哮喘慢性持续期阳虚痰盛型，亦可用于具有相同症状的其他咳喘病，具有较好的临床疗效[1-2]。

平喘颗粒是由9味中药组成的复方制剂，成分复杂，药效物质基础不明确，前期仅采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷、黄芪甲苷的含量，难以全面控制制剂质量[3]。因此，开发一种能够快速分析和表征平喘颗粒化学成分的方法，对于有效控制方剂质量，进一步研究其作用机制及二次开发均具有现实意义。

近年来，将液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度相结合，尤其是与高分辨质谱和多级质谱联合使用的技术手段，已广泛应用于中草药成分的分析，为研究天然产物开辟了全新的途径。在前期总结平喘颗粒药味已报道化合物一级质谱数据，以及研究系列对照品二级质谱裂解规律的基础上，结合AB SCIEX公司Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software提供的1 000多种 中 药对照品MS/MS谱图信息，本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术对平喘颗粒样品进行在线分离分析研究，利用UPLC一维的保留时间锁定化合物，通过二维的精确质量数和同位素峰度比确定分子式，再通过对照品比对或质谱裂解规律分析鉴定或推断结构式，旨为平喘颗粒的药效物质基础和质量控制研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC（美国Waters公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱）；AB SCEIX Triple-TOFTM5600+型质谱仪（AB SCI‐EX，USA，配有ESI源和APCI源）；数据采集软件：Analyst TF 1.6 software（AB SCEIX，USA）；数据处理软件系统：Peakview 2.0/masterview1.0 software（AB SCEIX，USA）、Markerview1.2.1（AB SCEIX，USA）、Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）。

KQ-300DB数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；BSA224S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；LG16-W高速离心机（北京京立离心机有限公司）；ATC2-5-U艾科浦超纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司）；MDF-382E（N）超低温冰箱（日本SANYO公司）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Fisher公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 药材与对照品

平喘颗粒样品由黑龙江中医药大学附属第一医院制备，规格10 g/袋。

芒柄花素（C-018-140126）、毛蕊异黄酮苷（M-020-1170926）、五味子乙素（W-001-140801）、绿原酸（RFS-L00701908029）、芒果苷（M-018-180511）、次黄 嘌 呤（C-069-181216）、氧 化 前 胡 素（Y-151-181008）由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；次乌头碱（798-9403）、酪氨酸（140624-200805）由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加甲醇分别制成约50 μg/mL的溶液作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取平喘颗粒5.0 g，精密称定，加75%（体积分数，下同）甲醇25 mL超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液13 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.3 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），AQUITY UPLC BEH C18VanGuard Pre-Column预柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱（0~5 min，5%~25%B；5~15 min，25%~65%B；15~20 min，65%~70%B；20~29 min，70%~100%B；29~30 min，100%~100%B；30～30.1 min，100%~5%B；30.1~35 min，5%~5%B）；柱温为30℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。

2.4 质谱条件

采用ESI离子源，离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正负离子源电压分别为5 500 V/-4 500 V，离子源温度为550℃，裂解电压（DP）分别为80 V/-80 V，碰撞能量（CE）分别为35 eV/-35 eV，碰撞能量扩展（CES）分别为15 eV/-15 eV。雾化气体为氮气，辅 助 气Gas1为379.225 kPa，辅 助 气Gas2为379.225 kPa，气帘气CurGas为241.325 kPa。一级质谱母离子扫描范围为m/z80~1 500，IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z50~1 500，开启动态背景扣除（DBS）。

2.5 数据分析

2.5.1 目标性筛查（1）利用已建成的平喘颗粒化合物一级质谱数据库（包括化合物分子式、分子量、中英文名称、CAS号、结构类型、植物来源及参考文献信息），使用Peakview 2.0/Masterview 1.0软件中的“Targeted Peak Finding”功能载入已选择的数据，设置Mass Error（质量数偏差）<10×10-6，权重=30%；Isotope（同位素分布）差异<10%，权重=30%；Formu‐la Finder score（分子式查找）>70%，权重=40%；利用masterview1.0软件目标筛查功能对组分样本进行筛查。（2）使用Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software（AB SCIEX，USA）进行筛查，该数据包含了1 000余种中草药对照品的二级谱图信息与样品中的化合物进行自动匹配。

2.5.2 非目标性筛查 将采集数据导入Masterview 1.0（AB SCIEX，USA）软件，通过peak finding options功能将数据中所有色谱峰按照设置参数母离 子 强 度>3 000 counts；S/N>10；MAX Element C50H200O50N20提取出来，按峰强度排序，选择离子强度大且二级谱图质量较好的化合物作为结构分析重点。

2.6 结构鉴定

在正负离子模式下，大多数化合物会产生[M+H]+或[M−H]−分子离子，Triple TOFTM 5600+高分辨质谱能够在化学位移δ=5误差范围内测定大多数离子的精确质量数，并准确测定同位素丰度比。因此，通过Peakview 2.0 software软件的Formula Finder功能，依据精确质量数及同位素丰度比可确定化合物的分子式。对于有对照品信息的化合物，进一步比对保留时间及二级质谱信息进行结构鉴定；对于无法获得对照品的化合物，首先，依据其碎片离子的精确质量数计算其碎片组成，对比chemspider数据库给出的可能结构式，再研究相似结构化合物的质谱裂解规律，通过Peakview 2.0软件分析化合物质谱裂解特征以及文献对比，结合二级谱图相似度，从而推断化合物结构。

3 结果与讨论

3.1 UPLC/Q-TOF/MS数据采集结果

由于平喘颗粒化学成分复杂，采用一种模式很难顾全所有的化合物，因此采用正负2种离子扫描模式进行扫描，正负离子模式下的总离子色谱图见图1。结果表明，在正负离子模式下，各化合物均获得了良好的分离效果及离子化效率。

图1 平喘颗粒正负离子模式下总离子流图Figure 1 TIC chromatograms of Pingchuan granules in positive and negative modes

3.2 结构鉴定

鉴定或推断了平喘颗粒中35个化合物的结构，包括15个黄酮类化合物，主要来源于黄芪、淫羊藿、太子参、款冬花、知母等药材；4个生物碱类化合物，来源于附子、罂粟壳及太子参；4个木脂素类化合物，全部来源于五味子；6个有机酸类化合物，分别来源于麻黄、款冬花、太子参、地龙、知母、附子；2个氨基酸类化合物，均来源于太子参、地龙；3个嘌呤类化合物，来源于太子参、地龙、知母；1个香豆素类化合物，来源于知母，结果见表1。

表1 （续）

表1 平喘颗粒中化合物结构信息表Table 1 Compound structure information of Pingchuan granules by UPLC-ESI-Q-TOF/MS

3.2.1 黄酮类成分的鉴定及分析 化合物1为黄芪、太子参、知母中共有的典型化合物，其准分子离子269[M+H]+丰度最高，首先A环上甲氧基断裂失去甲基并发生氢重排，形成253[M+H-CH4]+碎片离子，而此离子碎片同时发生3种裂解途径：一种失去C环上的CO中性碎片形成225[M+H-CO-CH4]+碎片离子，此碎片继续碎裂失去B环上的CO中性碎片形成197[M+H-2CO-CH4]+及181[M+H-2COOCH4]+碎片离子；另一个途径则失去B环上的4’-位的甲氧基形成237[M+H-O-CH4]+碎片离子，准分子离子也可A、C环发生裂解重排后产生213[M+HC2O2]+碎片离子。根据裂解方式及标准品比对[4]，推断化合物1为芒柄花素，其二级质谱、裂解可能途径分别见图2、图3。

图2 芒柄花素二级质谱图Figure 2 MS/MS spectrum for formononetin

图3 芒柄花素可能的裂解途径Figure 3 Possible fragmentation path way for formononetin

化合物2是黄芪、太子参共有的一个典型黄酮类成分，其准分子离子285[M+H]+丰度最高，其裂解路线较为单一，首先B环上4’-位甲氧基断裂失去甲基形成270[M+H-CH3]+碎片离子，此离子碎片进一步丢失4’-位的OH并与3’-位羟基发生重排而形成253[M+H-CH3-OH]+碎片离子，253碎片失去CO中性分子形成225[M+H-CH3-OH-CO]+碎片离子，并发生A环RDA反应开环失去1个C形成213[M+HCH3-OH-CO-C]+碎片离子；另一条裂解途径则由准分子离子直接丢失B环并发生重排产生碎片离子137[M+H-C9H8O2]+，此碎片提示A环上仅有1个羟基存在。根据裂解方式及对照品比对，推断化合物2为毛蕊异黄酮，其二级质谱、裂解可能途径分别见图4、图5。

图4 毛蕊异黄酮二级质谱图Figure 4 MS/MS spectrum for calycosin

图5 毛蕊异黄酮可能的裂解途径Figure 5 Possible fragmentation path way for calycosin

3.2.2 生物碱类成分的鉴定及分析 生物碱类成分结构较为复杂，化合物17为附子中典型的生物碱成分，其准分子离子616[M+H]+丰度最高，裂解途径分为两个方向：一个方向是失去饱和六元环上的甲氧基并发生氢的重排反应，形成584[M+H-OCH4]+碎片离子；另一个方向是失去饱和7元环上的乙酸根离子并发生氢重排形成556[M+H-CH3COOH]+碎片离子，此离子继续失去饱和六元环上的甲氧基并发生氢的重排反应，形成524[M+H-CH3COOHOCH4]+碎片离子，而此碎片发生一系列裂解失去苯基、CO、甲基及开环失去N基并发生重排后形成338[M+H-CH3COOH-OCH4-C12H12NO]+碎片离子。根据裂解方式及对照品比对[5]，推断化合物17为次乌头碱，其二级质谱、裂解可能途径分别见图6、图7。

图6 次乌头碱二级质谱图Figure 6 MS/MS spectrum for hypaconitine

图7 次乌头碱可能的裂解途径Figure 7 Possible fragmentation path way for hypaconitine

3.2.3 木脂素类成分的鉴定及分析 化合物21为五味子中典型的木脂素类成分，其准分子离子401[M+H]+的裂解分为两条路线：一条为连续失去一个甲基及O形成386[M+H-CH3]+碎片离子及370[M+HCH3-O]+碎片离子；另外一条则由准分子离子401[M+H]+的连续发生八元环断裂并发生重排反应形成300[M+H-5CH2-OCH3]+碎片离子，此碎片继续丢失甲基形成285[M+H-5CH2-OCH3-CH3]+碎片离子。根据裂解方式及对照品比对[6-7]，推断化合物21为五味子乙素，其二级质谱、裂解可能途径分别见图8、图9。

图8 五味子乙素二级质谱图Figure 8 MS/MS spectrum for schisandrin B

图9 五味子乙素可能的裂解途径Figure 9 Possible fragmentation path way for schisandrin B

3.2.4 有机酸类成分的鉴定及分析 化合物29为典型的常见有机酸类成分，其准分子离子355[M+H]+丰度比较小，说明准分子离子所需极少能量即可打碎，而准分子离子极易失去奎宁酰基形成丰度最高的163[M+H-C7H12O6]+碎片离子，此离子失去苯环上的1个H2O形成145[M+H-C7H12O6-H2O]+碎片离子，同时也能失去CO形成135[M+H-C7H12O6-CO]+碎片离子，继而失去苯环上的1个H2O形成117[M+H-C7H12O6-CO-H2O]+碎片离子。根据裂解方式及对照品比对[8]，推断化合物29为绿原酸，其二级质谱、裂解可能途径分别见图10、图11。

图10 绿原酸二级质谱图Figure 10 MS/MS spectrum for chlorogenic acid

图11 绿原酸可能的裂解途径Figure 11 Possible fragmentation path way for chlorogenic acid

3.2.5 氨基酸类成分的鉴定及分析 化合物31为常见氨基酸，其准分子离子182[M+H]+丰度比较小，裂解途径有两条路线，首先失去1个H2O及NH3中性碎片并发生环合反应形成147[M+H-H2O-NH3]+碎片离子，此离子发生开环反应失去2个C形成123[M+H-H2O-NH3-2C]+碎片离子，准分子离子亦可连续失去甲酸根及NH3形成136[M+H-HCOOH]+碎片离子和119[M+H-HCOOH-NH3]+碎片离子。根据裂解方式及对照品比对[9]，推断化合物31为酪氨酸，其二级质谱、裂解可能途径分别见图12、图13。

图12 酪氨酸二级质谱图Figure 12 MS/MS spectrum for tyrosine

图13 酪氨酸可能的裂解途径Figure 13 Possible fragmentation path way for tyrosine

3.2.6 嘌呤类成分的鉴定及分析 嘌呤类成分质谱碎片较少，可能由于分子量较小及结构较多环合很难形成碎片离子，化合物32为地龙中典型的嘌呤类成分，其准分子离子137[M+H]+可以失去1个H2O形成119[M+H-H2O]+碎片离子，准分子也可发生开环失去CHN并发生重排反应形成110[M+H-CHN]+碎片离子。根据裂解方式及标准品比对，推断化合物32为次黄嘌呤，其二级质谱、裂解可能途径分别见图14、图15。

图14 次黄嘌呤二级质谱图Figure 14 MS/MS spectrum for 6-hydroxypurine

图15 次黄嘌呤可能的裂解途径Figure 15 Possible fragmentation path way for 6-hydroxypurine

3.2.7 香豆素类成分的鉴定及分析 化合物35为知母中香豆素类成分，其准分子离子287[M+H]+失去支链形成丰度最高的203[M+H-C5H8O]+碎片离子，此碎片离子发生五元环开环反应并同时失去O形成147[M+H-C5H8O-C2O2]+碎片离子，147碎片离子进一步失去O形成131[M+H-C5H8O-C2O3]+碎片离子，也可失去CO形成119[M+H-C5H8O-C2O2-CO]+碎片离子。根据裂解方式及对照品比对，推断化合物35为氧化前胡素，其二级质谱、裂解可能途径分别见图16、图17。

图16 氧化前胡素二级质谱图Figure 16 MS/MS spectrum for oxypeucedanin

图17 氧化前胡素可能的裂解途径Figure 17 Possible fragmentation path way for oxypeucedanin

4 讨论

药效学研究表明，平喘颗粒具有较好的镇咳、祛痰、抗急（慢）性炎症、抗疲劳、抗乏氧、提高免疫力、平喘作用[10]；能减轻哮喘后的炎症反应，抑制细胞自噬信号通路[11]，改善和控制气道重塑过程中气道高反应和气道阻塞的状态，并可抑制EGF mRNA的表达[12]，从而保护肺部组织细胞，减轻哮喘发作。平喘颗粒还可以保护16HBE细胞，降低其凋亡率、自噬数量，抑制Caspase-3以及Beclin-1的表达[13]；可以抑制Akt、mTOR的磷酸化，从而抑制自噬的发生，可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关[14]。

本研究采用HPLC-Q-TOF/MS联用技术，首次对平喘颗粒的化学成分进行了系统研究，鉴定或推断了平喘颗粒中35个化合物的结构，包括15个黄酮类、4个生物碱类、4个木脂素类、6个有机酸类、2个氨基酸类、3个嘌呤类、1个香豆素类化合物。当中的部分成分具有显著的生物活性，如芦丁和芒柄花素能够抑制气道炎症与重塑的作用[15-16]，毛蕊异黄酮和槲皮素能减轻哮喘炎症反应[17-19]，木犀草素和五味子醇甲可以减少气道高反应性、降低气道阻力、减少黏液过多的分泌、减少炎性细胞对肺组织的浸润[20-21]，异鼠李素具有抑制炎症反应、修复肺组织、减轻组织损伤的作用[22]，五味子乙素能够逆转因哮喘导致的气道壁厚度增加的趋势、起到减轻病情的作用[23]，亚油酸可以抑制哮喘状况下过分活跃的免疫系统、减轻免疫损伤的发生[24]，等等。

本研究分析鉴定了平喘颗粒中35个化合物的结构，以黄酮类、生物碱类、有机酸类等为主，这些化合物的结构通过高分辨质谱得到了初步的推断，有助于系统了解平喘颗粒所含化学成分，并为活性成分的定向提取分析及质量控制方法的建立提供借鉴，也可以为组方中各药味所含化学成分的质谱裂解途径研究提供借鉴和参考。