间接免疫荧光法检测抗核抗体室内质控品制备和性能验证

高雪丹，苏真珍，黄卓春，胡静，王丽，杨滨

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是遗传因素和环境因素共同作用下由机体免疫系统对自身器官、组织、细胞等抗原成分产生免疫反应使其受到攻击，从而造成机体器官或组织免疫损伤及功能障碍的一类疾病[1-2]。近年来，自身免疫性疾病的发病率逐渐上升[3]，该类疾病发病隐匿，但在疾病早期就可检测到患者体内的自身抗体[4]，且自身抗体的检测对自身免疫性疾病的辅助诊断、分层分型、病情判断及预后判断也有重要意义[5]，因此准确的自身抗体检测尤为重要。抗核抗体(antinuclear antibodies，ANA)是最常见的一类自身抗体，主要用于预测、发现并及早干预系统性红斑狼疮(SLE)等ANA相关自身免疫性疾病[6]。

目前国内已有较多实验室开展了ANA的检测，检测方法主要为间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence，IIF)、酶联免疫吸附法(ELISA)等，其中IIF法为国际国内共识推荐的筛查自身免疫性疾病的金标准方法[7-9]。但该方法存在操作繁琐、自动化程度低、需人工肉眼判读结果等众多影响因素，目前国内外均缺乏权威机构提供可量值溯源的ANA检测商品化室内质控品，无法对IIF法检测ANA全过程进行质量监控，难以保证实验室检测结果的准确性，导致实验室检测难以达到规范化和同质化。目前有些厂商试剂盒虽有配套的ANA质控品，但往往并非血清基质，基质效应不明确，同时无法覆盖从样本稀释开始的整个检测过程。国内部分实验室虽有自制抗核抗体质控，但其制备流程和性能验证暂无可供借鉴的规范化操作程序或共识。为了有效监测并保证实验室IIF ANA检测的质量，本实验室采用ANA阳性患者血清样本制备IIF法检测ANA的室内质控品，并对其进行性能验证，同时应用全自动荧光图像采集仪(荧光判读仪)采集质控品荧光图像并判读荧光强度值作为验证指标，以建立适用于ANA临床检测的室内质控品自制和性能验证规范化程序。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.2 方法

1.2.1 血清样本来源

(1)收集1例ANA强荧光强度(滴度1∶3 200～1∶10 000，均质型或颗粒型)和数例无荧光反应(阴性)患者血清，由于本室已有数据(未发表)说明血清中抗dsDNA抗体检测具有一定不稳定性，因此选取的强阳性样本需排除dsDNA抗体相关ANA高滴度阳性。所选血清均为外观无溶血、无脂血、无黄疸及细菌污染的血清，并均由罗氏Cobas e801化学发光仪检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体和梅毒螺旋体抗体为阴性。

(2)ANA荧光强度及核型判定以肉眼荧光显微镜下以及荧光判读仪同时判定为滴度1∶3 200～1∶10 000，均质型或颗粒型单一核型为所需阳性样本(本实验以均质型为例)，肉眼及判读仪同时判定为荧光阴性为所需阴性样本。

1.2.2 室内质控品制备

(1)弱阳性质控品：准确量取2 mL强荧光强度血清与58 mL阴性血清以1∶30(从1∶3 200～1∶10 000稀释至目标滴度1∶100～1∶320)比例稀释阳性血清样本；阴性质控品：量取60 mL阴性血清混合。

(2)匀速搅拌5 min，而后将混合的血清置于56 ℃ 30 min条件下灭活，再以3 000 r/min离心15 min去除沉淀[10]。

(3)分装和保存质控品：弱阳性质控品分别以P1、P2、……、P60连续编号以带盖EP管(容量为1.5 mL)保存；阴性质控品分别以N1、N2、……、N60连续编号以带盖EP管(容量为1.5 mL)，匀速搅拌同时，将弱阳性和阴性混合血清分别分装至相应标示的EP管中，1 mL/支，共60支。分装完成后装入指定密封袋并清楚标示名称、制备人、制备时间等相关信息后放入-20 ℃冰箱冻存。剩余血清严格按照生物危险品进行废弃处理。

1.2.3 自制质控品性能验证

(1)均匀性验证及质控品赋值：在冻存分装好的质控品前选取编号P1、P11、P21、P31、P41、P51共6支弱阳性质控与N1、N11、……、N51共6支阴性质控品同时在IF Sprinter XL上按临床样本检测流程进行检测(起始稀释倍数1∶100)；弱阳性和阴性质控品的判定结果均值为质控品赋值，因半定量检测无法准确计算均值，此处以超过半数的判定结果为质控品靶值。

(2)稳定性验证：质控品制备好后即随机选取弱阳性及阴性质控品各1管，复溶后保存于2～8 ℃冰箱，每日随患者样本同批进行质控品检测，连续测定10 d，以验证质控品的短期稳定性；每隔30 d随机取用-20 ℃冻存的(弱)阳性及阴性质控品各一支，随当日患者样本同批进行质控品检测，持续12个月，以验证长期稳定性。

(3)采用自制质控品验证仪器重复性和仪器间一致性：随机选取阴阳性质控品各一管，在一台IF Sprinter XL仪器的同一批次检测上样顺序的前中后进行检测以验证批内重复性；同时在两台IF Sprinter XL仪器上每日随样本每批进行ANA检测，连续10 d，以验证批间重复性及仪器可比性。

所有性能验证结果均同时由双人阅片和荧光判读仪共同判读结果，在控的判断标准为弱阳性质控品同一核型质控品间及同一质控品多次检测结果间滴度梯度≤1个稀释度(滴度1∶100～1∶320)且荧光核型一致，阴性质控品结果均为阴性。

2 结果

2.1 均匀性验证及质控品赋值

所有弱阳性质控品在1∶100稀释倍数下进行检测并通过人工和荧光判读仪判读，均可判读为1∶100(4/6)或1∶320(2/6)均质型，所有阴性质控品均判读为阴性；荧光判读仪判读弱阳性质控品荧光强度的均值和变异系数(CV)分别为93.67和5.83%，阴性质控品均未显示荧光强度。本批次制备弱阳性质控品靶值为1∶100，阴性质控品靶值为阴性(表1)。

表1 ANA自制质控品均匀性验证Table 1 Uniformity verification of ANA home-made quality control product

2.2 稳定性验证

随机选取的弱阳性质控品在1∶100稀释比例下检测结果通过人工和荧光判读仪判读结果均在1∶100～1∶320之间，核型均为均质型，所有阴性质控品均判读为阴性；荧光判读仪判读弱阳性质控品短期(10 d)、长期(12月)及总体荧光强度值的均值和变异系数(CV)分别为85.5和9.90%，88.15和8.49%及87和9.24%，阴性均未显示荧光强度(表2)。

表2 ANA质控品短期及长期稳定性验证Table 2 Short-term and long-term stability verification of ANA quality control products

2.3 采用自制质控品验证仪器批间检测重复性和仪器间一致性

随机选取的弱阳性质控品在同批测试前中后顺序荧光滴度均为1∶320，荧光强度较稳定(表3)；批间检测重复性验证和仪器可比性中弱阳性质控品荧光滴度均在1∶100～1∶320范围内，且核型一致，阴性质控品均为阴性。在A台第1批、A台第2批和B台第1批的荧光强度均值分别为83.50、85.40和83.20，CV分别为6.76%、6.27%和7.99%，总体均值和CV分别为84.00和7.28%，当日不同批次弱阳性质控品荧光强度CV有80%的情况小于10%，阴性质控品均未显示荧光强度值(表4)。

表3 ANA质控品批内重复性验证Table 3 In-batch repeatability verification of ANA quality control products

表4 ANA质控品批间检测重复性及仪器可比性验证Table 4 Test repeatability and instrument comparability verification of ANA quality control products between batches

3 讨论

ANA是目前临床应用最广泛、最经典的一类自身抗体，采用IIF检测ANA也是国际国内共识所推荐的筛查自身免疫性疾病的金标准方法[7-9]。但IIF检测具有手工操作步骤多、荧光易淬灭、对检测人员水平要求高、结果判定主观性强等影响因素容易导致检测结果不准确和结果判读的不一致。因此，对IIF检测ANA的室内质量控制是保证ANA检测质量的重要措施[11]，但目前，国内基于血清基质的ANA商品化质控品尚未普及。国内外指南和文献中均有提到，在保证最小基质效应、足够的稳定性、较小的瓶间差的前提下，可使用源自临床标本的自制质控，且选择接近临界点或医学决定水平附近浓度的阳性或阴性质控品更容易检测出实验过程中的错误[9,12-13]。采用临床样本自制质控有方便获得、经济性强、无基质效应等较多优点[10]，但对于用IIF检测ANA的实验室自制质控品尚缺乏规范有效的制备流程和评价体系。因此，为更有效的保证ANA实验室检测结果的一致性和准确性，本实验室构建用于IIF检测ANA的自制弱阳性质控品制备和评价程序以进行室内质控。

目前国内大多数实验室仍采用传统荧光显微镜判读ANA结果，存在较多主观因素，如人员之间不一致、受已知滴度结果诱导等主观因素，同时肉眼判读也无法灵敏准确地判断出检测过程的系统性误差，难以保证检测结果的稳定性。且目前国内外公认的ANA滴度判定在上下一个滴度均可接受[11,16]，导致人工判读结果存在较大的异质性，本实验室首次采用全自动荧光判读仪对荧光片进行判读，并纳入其判读的荧光强度值，作为定量结果辅助衡量自制质控品的检测结果的稳定性。实验室定量结果能力验证和质量评价中需达到的性能要求在不低于国家标准和行业标准的基础上需按项目及实验室条件进行设置[17]，而目前国内行业标准中尚无针对自身抗体检测项目的允许不精密度(变异系数)[14,18]，且国内尚无实验室以ANA荧光强度值作为质量控制指标。本研究参考室间质评标准(1/3总允许误差)，以10%的CV作为ANA质控品荧光强度的质量控制标准。本实验室自制质控品进行性能验证的荧光强度值结果显示，该批次质控品在均匀性和稳定性上的荧光强度值变异系数基本在10%范围内。一方面说明本实验室自制ANA的质量基本符合临床需求，另一方面也说明自动判读荧光强度值在ANA结果判读中有一定的应用价值。且质控品的荧光强度值也可极大的帮助检验人员对临床样本荧光滴度的结果判读进行调整。已有研究显示具有采集图像并计算定量测定值功能的自动化荧光判读系统与ANA最终滴度存在明显相关性[19-20]，但其价值仍有待进一步研究。

本研究自制质控品在性能验证方面表现良好，但仍存在一些局限性。ANA是一组最常见的自身抗体，公认的以Hep-2细胞为基质的ANA靶抗原已有100～150种之多[8]，其对应的ANA在IIF检测中有不同的表现核型，同一种核型也可对应多种自身抗体。在ANA质控品自制过程中，几乎无法实现制备可覆盖大多数ANA种类的质控品，受成本限制也难以制备和同时使用多种单一核型或复合核型的质控品，故本研究选取临床上相对常见，且与最常见的自身免疫性疾病系统性红斑狼疮相关性较高的荧光核型均质型作为质控核型。该核型质控品基本可实现全操作流程的监控，可识别检测过程中可能出现的错误，但无法验证其他核型可能受到的未知影响。因此，对于不同核型的检测是否需要不同的质控品以保证质量仍需进一步验证。另外，因作为临床每日常规使用质控品，本研究选取的临床样本需进行灭活后再使用，本研究未进行详细的灭活前后的一致性分析，因此对于ANA在灭活条件下是否会有抗体效价和结构的改变仍有待下一步讨论。

综上，经采用人工判读和荧光判读仪判读的荧光强度值共同验证的本实验室自制的抗核抗体质控品具有较好的均一性和稳定性，可满足临床需求，保证抗核抗体检测质量，并可为其他实验室制备和验证抗核抗体质控品提供参考。