短程大剂量阿托伐他汀对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型的作用

杨 伟 贺 超 张再强 吴 辉 滕 林 丁家望

(1. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 心血管内科 & 三峡大学 心血管病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 湖北省缺血性心血管疾病临床医学研究中心， 湖北 宜昌 443003)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种常见病和多发病，是心脑血管疾病的病理基础。临床流行病学调查发现，患有AS的患者最终均会发生心脑血管病变，而心脑血管疾病诱发的死亡约占疾病死亡的第四位[1]。其中AS导致的急性冠脉综合征为最常见的AS性心脏病[2]。经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)是治疗急性冠脉综合征的有效方法。研究发现，PCI术前12 h给予大剂量阿托伐他汀可明显减少围手术期心肌梗死等心血管事件[3]。从治疗获益时间来看，其机制显然不可能是通过降低血脂和改善粥样硬化斑块获得。相关动物研究发现，阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[4,5]。但是短时大剂量阿托伐他汀对于粥样斑块影响的研究则较少。本研究应用AS模式动物小鼠，探究短疗程大剂量阿托伐他汀对AS斑块的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

70只4周龄雄性载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-/-，apoE-/-)小鼠(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产合格证号:SCXK(京)2016-0006，均无生育史)，体重17～22 g，适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为空白组(n=5)和造模组(n=65)。

1.1.2 动物造模方法和分组

造模组根据经典AS造模方法[6]给予高脂饮食(高脂混合饲料：1.5%胆固醇、10%蛋黄粉、5%猪油加普通饲料)喂养6周，之后剖杀空白组和造模组随机小鼠各5只以确认AS造模成功。之后将60只造模组小鼠随机分为普通饲料喂养组(对照组)、高脂组(模型组)、阿托伐他汀常规剂量+高脂组(常规剂量组)、中剂量+高脂组(中剂量组)，每组各10只；高剂量+高脂组(高剂量组)20只。

1.1.3 实验药物及给药方法

阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司，国药准字H20051407 ，规格：10 mg×7片， 7片/盒)的成人剂量为10 mg/d。根据《实验动物药理学》[7]小鼠(20 g)与人(70 kg)的常规药物换算系数为9.1，则每只小鼠服药量为2.5 mg/(kg·d)。即常规剂量组灌胃为2.5 mg/(kg·d)，中剂量组为5.0 mg/(kg·d)，高剂量组为10 mg/(kg·d)。采用0.9%生理盐水溶解药物后灌胃，灌胃量为0.1 mL/只，1次/d，连续灌胃2周。其中高剂量组动物再分为负荷剂量组(10只)和非负荷剂量组(10只)，负荷剂量组于干预结束前2 h追加阿托伐他汀2.5 mg/kg，非负荷剂量组不追加。对照组和模型组分别给予普通饲料和高脂饲料继续喂养2周。

1.2 动物处理

药物灌胃2周后，断颈处死小鼠，眼球取血，采用高速离心机(Thermo，USA)3 500 r/min离心10 min，取血清-80℃保存、备用。

1.3 指标检测

1.3.1 ELISA试剂盒检测脂蛋白水平及炎症因子水平

各组取胸主动脉组织约0.5 cm，加0.5 mL生理盐水匀浆2 min，500 r/min离心5 min，取上清液于-80℃保存。按照ELISA试剂盒说明书的步骤，测定各组小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)(南京建成生物工程公司，批号：20201118847)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)(南京建成生物工程公司，批号：20201118786)、氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidative low density lipoprotein cholesterol，ox-LDL)(南京建成生物工程公司，批号：20201118684)水平；各组小鼠血清和斑块内肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)(天根生化科技有限公司，批号：20201017879)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)(天根生化科技有限公司，批号：20201016679)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)(天根生化科技有限公司，批号：20201015379)的水平。

1.3.2 血小板计数及血小板膜蛋白检测

采用血细胞计数仪检测外周血的血小板数量(platelet，PLT)。根据公式计算细胞数：细胞数量=(4个大格细胞总数/4)×稀释倍数(10)×106。应用流式细胞仪检测血小板膜蛋白CD62P、CD31的平均荧光强度，采用FlowJo软件进行分析。

1.3.3 胸主动脉HE染色

取约0.5 cm胸主动脉组织， PBS液冲洗约3 min，4%甲醛固定24～48 h，10%、20%、30%蔗糖梯度脱水各1 d、3 d后石蜡包埋、切片。石蜡切片后常规HE染色，中性树脂封片，血管内斑块面积采用自动成像分析软件系统(Olympus)分析，每只动物取 5张切片计算斑块面积平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理。计量资料采用均数±标准差(x±SD)表示，数据符合正态分布组间比较则采用方差分析，不符合则采用秩和检验。计数资料采用频数 (%)表示，组间差异采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清HDL-C、LDL-C、ox-LDL水平比较

灌胃期间模型组小鼠死亡1只，其余组小鼠无死亡。与模型组比较，对照组、常规剂量组、中剂量组、负荷剂量组和非负荷剂量组HDL-C均显著增高(均P<0.05)，LDL-C均显著降低(均P<0.05)。与模型组比较，负荷剂量组ox-LDL降低(P<0.05)，具体见表1。

表1 各组血清HDL-C、LDL-C、OX-LDL水平比较

2.2 各组血清及斑块内TNF-α、IL-6、MCP-1水平比较

与模型组比较，对照组及药物干预组血清TNF-α、IL-6、MCP-1均显著降低(均P<0.05)。负荷剂量组血清TNF-α、IL-6、MCP-1明显低于对照组和其他三组药物组(均P<0.05)。中剂量组、负荷剂量组、非负荷剂量组血清TNF-α、IL-6、MCP-1均低于对照组(均P<0.05)。各组斑块内TNF-α、IL-6、MCP-1与血清中各炎症因子的表达趋势一致，具体见表2。

表2 各组血清及斑块内TNF-α、IL-6、MCP-1水平比较

2.3 各组PLT、CD62P、CD31水平比较

与模型组比较，对照组及药物干预组PLT均明显减少，CD31和CD62P荧光强度均显著降低(均P<0.05)。与对照组比较，药物干预组CD31荧光强度明显下降(均P<0.05)，具体见表3。

表3 各组PLT、CD31、CD62P水平比较

2.4 各组主动脉内斑块面积比较

与模型组比较，常规剂量组、中剂量组、负荷剂量组和非负荷剂量组斑块面积显著减小(均P<0.05)，具体见表4。

表4 各组主动脉校正斑块面积

3 讨论

预防斑块破裂、出血、扩张堵塞血管是治疗并改善AS患者预后的有效途径。阿托伐他汀属于他汀类调脂药物，是临床常用的AS基础性治疗药物[8]。药理学认为，阿托伐他汀是一种选择性较强的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，通过降低酶活性达到减少胆固醇合成的目的，在控制血脂的同时，还能通过降低CD31等血小板聚集性蛋白的表达发挥抗血小板聚集的作用[9]。另外，阿托伐他汀也可能通过抑制炎性细胞在主动脉的聚集、浸润，并下调炎性因子，如血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule -1，VCAM-1)和MCP-1在主动脉内膜的表达，抑制炎症反应、拮抗AS的发生[10]。PCI术前12 h给予大剂量阿托伐他汀可明显减少围手术期心肌梗死等心血管事件的发生率[3]。短时大剂量阿托伐他汀是如何影响动脉粥样斑块，继而减少围手术期心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病发生风险，目前尚未可知。

本研究以AS模型小鼠为研究对象，发现阿托伐他汀能够通过降低LDL-C、提高HDL-C，抑制TNF-α、IL-6、MCP-1等炎症因子水平，拮抗血小板聚集，最终缩小斑块面积达到治疗AS的目的，与之前的研究相一致[11]。虽然常规剂量组、中剂量组、负荷剂量组和非负荷剂量组都能改善上述指标，但仅负荷剂量组可降低ox-LDL。AS时激活氧化应激及血管局部炎症反应，产生过量的超氧化物、氧自由基，使LDL氧化修饰成ox-LDL[12]。巨噬细胞吞噬ox-LDL成为泡沫细胞，是形成AS的重要条件。而通过降低LDL，尤其是ox-LDL水平则可以显著降低心血管事件的发生率[13]。

炎症活化贯穿于AS的整个病理生理过程, 血管内皮细胞损伤后，白细胞粘附到内皮，激活免疫细胞释放IL、TNF等炎症介质，后者促使巨噬细胞表达清道夫受体，大量摄取ox-LDL形成泡沫细胞，炎症激活不但加速AS的发生和发展，还参与血栓形成，促进斑块破裂[14]。Abela等[15]研究发现，下调血清TNF-α和IL-6水平可以显著降低AS患者心血管意外事件的发生率。无论如何谨慎的操作，PCI术对于动脉斑块的“激惹”均难以避免。与术前相比，PCI术后患者体内炎症因子水平显著增加是导致不良心血管事件发生的重要因素[16]。而早期大剂量应用阿托伐他汀可能通过抑制炎症反应而减少心血管事件的发生。MCP-1是由血管内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞分泌的一种趋化因子，具有趋化活性，并可活化单核/巨噬细胞。炎症因子是激活上述细胞分泌MCP-1的主要介质[17]。本研究发现，与斑块内炎症因子相比，阿托伐他汀降低血清炎症因子的作用更强，可能与药物代谢分布有关。

凝血过度激活也是心血管事件的重要诱因。斑块破裂，纤维素、细胞坏死物质、泡沫细胞等内容物溢出，激活血小板诱发弥散性血管内凝血，微小血栓随血流阻塞心脑微小血管是造成心肌梗死、广泛性脑缺血梗死的主要因素[18]。谭朝阳等[19]研究发现，与低剂量相比，高剂量阿托伐他汀降低血小板聚集率、血小板粘附率的效果更为显著。Deng等[20]研究则认为，大剂量阿托伐他汀不仅能够降低血小板浓度，抑制血小板激活，同时也能够显著降低血脂水平和炎症因子浓度。阿托伐他汀抑制血小板激活可能与降低血小板表面粘附性蛋白CD31等表达有关。血脂、炎症因子、血小板等促AS物质减少，斑块面积则显著缩小[21]。

综上所述，短程大剂量阿托伐他汀可能通过降低血脂水平，抑制相关炎症因子释放，调节血小板数目及血小板膜蛋白的表达，进而干预AS斑块形成。