子痫前期大鼠胎盘细胞自噬水平变化及黄芩苷的干预作用

徐秋莲，王建芳，徐恒，牛艳昕，戴希望

金华市人民医院 产科，浙江 金华 321000

子痫前期（preeclampsia,PE）是以高血压和蛋白尿为主要表现的产科常见病[1]。PE的发生与胎盘细胞异常反应密切相关[2]。自噬是真核细胞对不良环境刺激的一种防御机制[3]。然而，自噬过度或自噬不足均可导致疾病的发生[4]。当自噬发生时，Beclin 1和LC3 蛋白表达增加，而P62蛋白表达减 少[3-4]。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，属于黄酮类化合物，是祖国医学多种保胎处方中的主要药物之一，对PE具有抗氧化、抗炎、抗兴奋性氨基酸毒性和抗凋亡等作用[5-6]。黄芩苷对自噬有双向调节作用[7-8]。本研究采用亚硝基左旋精氨酸甲酯皮下注射制作PE大鼠模型，使用黄芩苷和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）作为干预手段，揭示胎盘细胞自噬与PE发生的关系及黄芩苷对胎盘细胞自噬的干预作用，从而为完善PE的发病机制研究和黄芩苷用于临床治疗PE提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar孕鼠（清洁级，体质量220～250 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，以实验鼠阴道发现精子并有阴栓脱落当日确定为妊娠第1日）；亚硝基左旋精氨酸甲酯（规格：500 mg/支，美国Sigma公司）；3-MA（50 mg/支，北京乐博生物科技有限公司）；黄芩苷注射液（5 g/支，上海脉铂医药科技有限公司）；倒置拍照显微镜（IX51，上海徕卡公司）；无菌操作台（SW-CJ-1FD，苏州净化有限公司）；低速离心机（5702R，上海卢湘仪器厂）；垂直电泳槽（DYCZ--24DN，北京六一仪器厂）；电转仪（DYCZ-40，北京六一仪器厂）；水平摇床（TS-1，海门其林贝尔仪器制造有限公司）；尾动脉血压监测仪（ALC-NIBP，上海奥尔科特公司）；全自动生化分析仪（AU5831，苏州贝克曼库尔特生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模：本动物实验经医院伦理委员会审核批准，将48只Wistar孕鼠随机分成4组，每组12只。正常妊娠组大鼠自妊娠13 d起连续皮下注射0.9%氯化钠溶液1.5 mL/d至妊娠21 d。子痫前期组大鼠自妊娠13 d起连续皮下注射亚硝基左旋精氨酸甲酯100 mg/（kg·d）至妊娠21 d制作PE动物模型[9]。黄芩苷组和自噬抑制组大鼠除了子痫前期组处理外，同时从妊娠16 d起，每天分别给予腹腔注射黄芩苷50 mg/（kg·d）[10]和3-MA 15 mg/（kg·d）[11]至妊娠21 d。在妊娠21 d，应用尾动脉血压监测仪测定大鼠尾动脉血压[12]，收集大鼠24 h尿液，应用全自动生化分析仪测定大鼠24 h尿蛋白含量[12]。

1.2.2 蛋白质印迹（Western blot）：取每组大鼠胎盘组织，采用BCA法测定蛋白浓度，采用标准的免疫印迹方法，使用β-actin（1:1 000）、Beclin 1（1:2 000）、LC3-II（1:2 000）和P62（1:1 000）等兔抗大鼠一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（1:2 000），采用ImageJ软件分析Western blot结果，以β-actin水平为内对照，比较相对灰度值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白水平比较 子痫前期组较正常妊娠组尾动脉收缩压和舒张压及24 h尿蛋白水平显著升高（P＜0.05），黄芩苷组和自噬抑制组较子痫前期组尾动脉收缩压和舒张压及24 h尿蛋白水平显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组孕鼠尾动脉血压及尿蛋白水平比较（每组n=12，±s）

2.2 各组孕鼠胎盘细胞Beclin 1、LC3-II和P62 蛋白表达水平比较 子痫前期组较正常妊娠组大鼠胎盘细胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表达水平显著增高（P＜0.05），而P62蛋白表达水平显著减少（P＜ 0.05）；黄芩苷组和自噬抑制组较子痫前期组大鼠胎盘细胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表达水平显著减少（P＜0.05），而P62蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组孕鼠胎盘细胞Beclin 1、LC3-II和P62蛋白表达水平比较

3 讨论

PE是一种始于胎盘、累及全身多脏器的，对孕产妇和胎儿甚至有致命影响的并发症，临床常表现为高血压和蛋白尿[1]。亚硝基左旋精氨酸甲酯皮下注射是制作PE动物模型的经典方法[9]。本研究采用此方法制作大鼠PE模型，在妊娠21 d测量大鼠尾动脉血压及24 h尿蛋白水平，结果显示，PE大鼠的尾动脉收缩期和舒张期动脉压及24 h尿蛋白水平均高于正常妊娠大鼠。

PE发生发展机制涉及胎盘及全身多脏器的炎症反应、血管内皮细胞激活和细胞凋亡等复杂的病理生理过程[2]。但PE的发生发展机制研究尚不完善，这也阻碍了PE治疗药物的研发。自噬是一种在真核细胞中通过双层膜状结构的自噬体包裹隔离待降解底物，并将其运输至溶酶体进行降解和回收再利用的分解代谢过程，主要发生在缺氧、免疫损伤、应激和营养缺乏等情况下，被认为是细胞对不良环境刺激的一种防御机制。然而，自噬过度或自噬不足均可导致疾病的发生。自噬相关的基因有Beclin 1、LC3-II和P62 等。当自噬发生时，Beclin 1和LC3-II表达增加，而P62表达减少。这些蛋白表达程度的变化可以用于反映机体或细胞自噬的发生[3-4]。自噬参与肿瘤、神经退行性病变、心血管疾病、感染和免疫功能缺陷等多种疾病的病理过程[13-15]。自噬相关的研究是目前学术界的热点。

近年来，一些学者对自噬与PE发病的相关性也进行了研究报道。在胎盘的标本中，PE胎盘细胞Beclin 1和LC3-II蛋白及mRNA表达增加，而P62蛋白及mRNA表达减少[16]。然而，关于自噬对PE中的滋养细胞是促进其存活还是导致其死亡或功能损伤尚不明确。本研究制作PE大鼠模型同时采用自噬抑制剂3-MA作为干预手段，数据显示，PE大鼠确实存在胎盘细胞Beclin 1和LC3-II蛋白表达增加，而P62蛋白表达减少，而3-MA腹腔注射可以逆转自噬相关蛋白在PE大鼠胎盘细胞的表达水平，同时也可显著降低大鼠尾动脉血压及抑制24 h尿蛋白水平。因此，胎盘细胞自噬可能参与大鼠PE的发生发展过程，而抑制自噬可能成为PE治疗的新途径。

黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗兴奋性氨基酸毒性、抗凋亡等生物活性。黄芩苷已用于临床治疗肝损伤、脑损伤、视网膜病变和糖尿病肾病[5-6]。黄芩是祖国医学多种保胎处方中的主要药物之一。因此，黄芩苷对胎儿及孕妇是安全可靠的。已有研究证实，黄芩苷对PE具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[5-6]。最近，有研究显示，黄芩苷对自噬有双向调节作 用[7-8，17-18]。但黄芩苷对PE胎盘细胞自噬的调节作用不得而知。本研究揭示，黄芩苷不仅可以抑制胎盘细胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表达，而且能够提高P62蛋白表达，同时也可显著降低大鼠尾动脉血压及抑制24 h尿蛋白水平。因此，黄芩苷对PE大鼠具有治疗作用，而抑制胎盘细胞自噬可能是黄芩苷治疗作用的重要机制之一。

综上，本研究在动物实验中揭示黄芩苷对PE具有治疗作用，而抑制胎盘细胞自噬可能是黄芩苷治疗作用的重要机制之一。