降低脂筏内integrin β1减轻HPS大鼠血清诱导PMVECs增殖和迁移

高 静，周家奇

(1.浙江大学医学院附属儿童医院 麻醉科，浙江 杭州 310000；2.浙江大学医学院第一附属医院重症医学科，浙江 杭州 310000)

肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或门脉高压的基础上出现肺内微血管异常扩张(intrapulmonary vascular dilation,IPVD)、血管新生而导致的氧合异常综合征，也是引起围术期移植肝无功能及肺部感染的主要原因[1-3]。既往研究认为肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的异常增殖、迁移引起肺血管重塑在其中发挥了重要作用[4-5]。本课题组前期研究发现脂筏(lipid raft)在血管内皮细胞异常增殖和迁移过程中发挥了重要重用，但其确切机制不清。本研究发现脂筏内integrin β1通过激活integrin β1/FAK通路进而促进细胞增殖、迁移和血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，可能介导了肝肺综合征的肺血管重塑过程。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠及细胞：雄性SD大鼠(SPF级，250～300 g/只，浙江省医学科学院动物中心)；原代大鼠肺微血管内皮细胞(Cell Biologics公司)。

1.1.2 试剂及试剂盒：CCK-8试剂、甲基-β-环糊精(MβCD)(Sigma-Aldrich公司)；ECM培养基(Science Cell公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；DMSO(国产分析纯)、VEGF-ELISA试剂盒(依科赛公司)，青霉素-链霉素溶液(上海碧云天生物技术有限公司)，HRP标记山羊抗小鼠二抗、HRP标记兔抗山羊二抗、抗 FAK 鼠单克隆抗体和抗 pY397FAK 兔单克隆抗体(北京康为生物科技有限公司)，EntransterTM-R(北京英格恩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPS大鼠血清的制备：腹腔注射3%戊巴比妥钠 (0.1 mL/100 g)麻醉，沿腹正中进腹，暴露并充分游离胆总管，分别在近肝门处和近十二指肠处结扎并剪断，关腹[4]。建模后4周在无菌操作下抽取腹主动脉血，4 ℃离心取上清，56 ℃加热30 min以灭活补体，-80 ℃保存。

1.2.2 细胞的分组及处理：将PMVECs分为：1)对照组：10%健康大鼠血清刺激组；2)HPS组：10%肝肺综合征大鼠血清刺激组；3)MβCD组：事先用0.01 mol/L MβCD预处理细胞1 h；4)si-integrin β1敲低组：利用siRNA技术转染靶向敲低integrin β1基因。体外合成特异性 integrin β1 siRNA，转染前1天将1×106个PMVECs接种于100 mm培养皿，加入10 mL全培养基。取1个离心管加入20 μg RNA，然后加入无血清 DMEM 充分混匀，制成250 μL的RNA 稀释液，另取1个离心管，加入EntransterTM-R 60 μL，然后加入190 μL无血清DMEM，充分混匀，制成 250 μL的EntransterTM-R稀释液，室温静置5 min。将EntransterTM-R稀释液加入到RNA稀释液，立即充分混匀。转染后6 h观察细胞状态。培养24 h后检测mRNA水平，48 h后检测蛋白表达水平评价siRNA转染后integrin β1的沉默效率。后3组用10%肝肺综合征大鼠血清的ECM培养基培养。孵育48 h，进行后续实验。

1.2.3 脂筏提取：采用密度梯度离心分离法提取脂筏。收集细胞，加入裂解液，4 ℃静置30 min，配置密度梯度，调节细胞裂解物至40% OptiPrep，密封在含有30%和10%的OptiPrep提取缓冲液中，可见明显分层，然后4 ℃，35 000×g离心16 h，片段由等体积的去污剂不溶性富含糖脂复合体(detergent insoluble glycolipid rich complex,DIG)和非等体积的DIG组成，收集非DIG，免疫印迹检测，显影目标蛋白条带。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：收集细胞，加入改进RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000×g离心10 min，取上清并测定其浓度后，SDS-PAGE分离转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜，含0.05% Tween TBS洗膜5 min×3次，二抗孵育2 h，TBS液洗膜3次，化学发光剂于暗室中显影并感光，图像定量分析。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖：1)细胞接种：96孔板中均匀接种100 μL细胞悬液。放培养箱预培养24 h(37 ℃，5% CO2)。2)处理：向孔板中加入10 μL不同的待测物质，将培养板在培养箱孵育24、48 h。3)加CCK溶液：向孔板中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1～4 h。4)用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。

1.2.6 细胞迁移的测定：将盖玻片置于6孔培养板中，接种传代培养PMVECs，细胞汇合后，取出盖玻片，显微镜下用无菌细胞刮刀将盖玻片上的细胞沿直线刮除一侧，放入培养板，继续培养24、48 h，显微镜下观察细胞迁移情况，以测定迁移最远的PMVECs至刮线边缘的距离为细胞的迁移距离。每组观察16个盖玻片的细胞迁移距离，取均值。

1.2.7 测定上清VEGF浓度：以ELISA检测各组VEGF浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肝肺综合征血清刺激integrin β1脂筏聚集

脂筏区域(raft)：与对照组比较，HPS组脂筏内的integrin β1表达显著增加(P<0.05)；而在给予脂筏解离剂MβCD后，对照组和HPS组脂筏内的integrin β1表达显著降低(P<0.05)；非脂筏区域(non-raft)：与对照组比较，HPS组脂筏外integrin β1表达有所减少(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HPS group图1 肝肺综合征大鼠血清对细胞脂筏内外integrin β1表达的影响Fig 1 Effect of HPS rat serum on integrin β1 inside and outside lipid

2.2 脂筏内integrin β1表达上调促进FAK磷酸化

与对照组相比，HPS组pY397FAK磷酸化水平显著升高(P<0.05)；与HPS组相比，MβCD组和si-integrin β1组pY397FAK磷酸化水平受到显著抑制(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group图2 脂筏内integrin β1聚集对细胞FAK活性变化的影响Fig 2 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the activity of FAK among different groups

2.3 脂筏内integrin β1表达上调促进了肝肺综合征血清诱导的细胞增殖

与对照组相比，HPS组细胞增殖能力在24和48 h时增强(P<0.05)；与HPS组相比，MβCD组和si-integrin β1组细胞增殖能力在24和48 h时显著减弱(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group图3 脂筏内integrin β1聚集对细胞增殖的影响Fig 3 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell proliferation among different

2.4 脂筏内integrin β1表达上调促进了肝肺综合征血清诱导的细胞迁移

与对照组相比，HPS组细胞迁移距离在24和48 h时增强(P<0.05)；与HPS组相比，MβCD组和si-integrin β1组细胞迁移距离在24和48 h时显著减弱(P<0.05)(图4)。

arrow shows cell migration distance;*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group图4 脂筏内integrin β1聚集对细胞迁移的影响Fig 4 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell migration among different

2.5 脂筏内integrin β1表达上调促进了肝肺综合征血清诱导VEGF表达

与对照组相比，HPS组细胞VEGF分泌水平在24和48 h时增强(P<0.05)；与HPS组相比，MβCD组和si-integrin β1组细胞VEGF分泌水平在24和48 h时显著减弱(P<0.05)(表1)。

表1 脂筏内integrin β1聚集对细胞VEGF表达的影响Table 1 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the expression of VEGF among different

3 讨论

尽管HPS的研究逐渐成为研究热点，但是临床上仍缺乏有效的防治手段，对HPS分子机制的深入研究可为HPS的防治提供有效途径[1，6]。目前的研究认为HPS的病理过程为原发肝病-肺微血管重塑-低氧血症三联征，其中以肺微血管重塑为主要病理改变[7]。前期研究发现PMVECs 的异常增殖、迁移可能发挥了作用，但确切机制尚待进一步研究[8-9]。

Integrin β1主要介导细胞与胞外基质间的连接，并影响胞外信号向胞内的传递；在细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学过程中发挥重要的调控作用[10-12]。脂筏是细胞膜上富含鞘磷脂和胆固醇的液态微区，大量的蛋白和脂类分子富集于此，成为膜动态变化和细胞信号传导的平台。早期的研究认为integrin并不定位在脂筏上，但近年的研究发现，integrin不仅能定位在脂筏区域，而且其功能的发挥还受到脂筏影响[12]。本研究发现：与对照组比较，HPS组脂筏内的integrin β1表达上调；用MβCD扰乱脂筏结构，可以有效阻止脂筏内integrin β1的表达，表明脂筏内integrin β1的表达依赖于脂筏结构的完整性。

黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，是细胞内多条信号传导途径的交汇点，激活下游多条信号传导途径[13-14]。HPS患者肝脏解毒功能下降，有害代谢产物，在细胞炎性因子等刺激下，胞质中的FAK可靶向到细胞膜，并定位到脂筏内，活化的FAK进而激活Ras-MAPK、PI3K和STAT等多条信号传导通路[15]。本研究发现：与对照组比较，HPS组FAK活化水平显著增高，细胞增殖、迁移和VEGF分泌显著增加；而在给予脂筏解离剂MβCD或小干扰RNA敲低integrin β1表达后，FAK活化水平受到显著抑制，细胞增殖、迁移和VEGF分泌显著降低，表明肝肺综合征血清通过诱导脂筏内integrin β1表达上调，进而增加pY397FAK活化水平，促进细胞增殖、迁移和VEGF分泌。

总之，本研究发现脂筏内integrin β1表达上调通过激活 integrin β1/FAK通路进而促进细胞增殖、迁移和VEGF分泌，可能介导了肝肺综合征的肺微血管重塑，有望成为临床治疗的潜在靶点。