山东一规模化驴场主要细菌病的流行病学与防控研究

朱曼玲，齐鹏飞，丁召亮，刘文强，程国明，杨宏军，王长法，张伟

（1.聊城毛驴高效繁育与生态饲养研究院，山东 聊城 252000；2.山东省农业科学院，山东 济南 250100；3.山东东阿黑毛驴牧业科技有限公司，山东 聊城 252000；4.东营市畜牧兽医站，山东 东营 257091）

山东省规模化驴场存栏量占全省驴存栏总量的80%左右，其组织化、规模化程度居全国前列。规模化养驴比传统分散养殖在饲养管理、营养调配、环境控制等方面均发生了较大变化，但在疫病防控、绿色生产等方面相对于其它畜禽的养殖水平仍有差距。驴驹腹泻问题严重，导致繁殖率、生产性能下降，严重影响了养殖效益。为明晰集约化驴场细菌感染及流行状况，为规模化驴场提供科学防控策略，本试验于2018—2020年对山东一规模化驴场进行了系统的流行病学调查与研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 从驴产业优势聚集区山东聊城某规模化驴场采集新鲜的临床组织病料液氮保存运输，肠道拭子4℃保存运输。

1.1.2 主要试剂 5%绵羊鲜血平板、营养肉汤琼脂平板、营养肉汤培养基、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、EasyPureⓇBacteria Genomic DNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；DL 2000 DNA Marker，购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离培养 将采集的冷藏病料组织置于超净工作台中，用接种环取病料组织内部并接种至5%绵羊鲜血平板培养基中，置于37℃恒温箱培养24 h，观察菌落形态。挑取优势单个菌落接种于营养肉汤琼脂平板培养基中进行纯化培养。

1.2.2 OTUs聚类和物种分类分析 采用CTAB法提取样品基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，备用。根据所扩增的16S rDNA区域特点，构建小片段文库，基于Illumina NovaSeq测序平台对该文库进行双末端测序。对测序得到的原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，然后基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析。根据OTUs聚类结果，对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况；同时对OTUs进行丰度计算和花瓣图等分析［1－3］。

1.2.3 小鼠致病性试验 将18～22 g的SPF级昆明小鼠随机分为2组，每组10只，感染组每只注射0.2 mL（1.8×109cfu/mL）大肠杆菌菌悬液，健康对照组每只注射0.2 mL无菌PBS溶液，均采用腹腔注射方式。接种后在相同的环境下隔离饲养，观察7 d，记录临床症状、死亡时间和数量。

1.2.4 剖检小鼠与病理组织学观察 对攻毒后死亡的小鼠剖检观察各组织脏器病变。取小鼠的病变脏器，制作石蜡切片，常规苏木素－伊红（HE）染色，光学显微镜观察攻毒后小鼠脏器的病理组织学变化。

1.2.5 疫病防控 针对驴驹出生20天后至断奶期间出现的腹泻突出问题，对4个圈舍的345头驴（驹）连续2周不间断进行摸排，将发病的进行特殊标记编号，并灌服制剂一进行治疗。根据16S rDNA高通量测序结果，另选取出现腹泻症状的驴驹60头，体重50～60 kg，随机分为4组，每组15头。1组:制剂一（短小芽孢杆菌与植物乳杆菌等）加少量水溶解，灌服计量50×108cfu/头，每天2次；2组:母子安散按照0.1 g/kg饲喂，每天2次；3组:白头翁散按照0.1 g/kg灌服，每天2次；4组:10%盐酸环丙沙星注射液，每10 kg体重肌肉注射1.25 mL，每天1次。治疗周期为5天。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离和鉴定

本试验共分离大肠杆菌12株、志贺氏菌3株、克雷伯菌1株。参照其他物种致病性大肠杆菌毒力因子的检测标准对驴源大肠杆菌进行分析，发现其没有K88、K99、937P和F41等毒力基因，采用MLST分型方法对分离到的菌株进行分型，目前分离到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

2.2 细菌群落结构

通过对样品深度测序解析样本中的病原RNA序列，结果表明:驴体内微生物分为细菌（95%）、古细菌（3%）和病毒（2%）三大类。细菌隶属于14门22纲41目71科119属。在门水平上，样本中细菌物种组成丰度较高的有变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、脱铁杆菌门、梭杆菌门、疣微菌门，其中丰度最高的是变形菌门和厚壁菌门（图1）。在纲水平上，细菌物种丰度大于5%的有丙型变形菌纲、芽孢杆菌纲、梭菌纲，其中丙型变形菌纲是优势细菌物种。在目水平上，细菌物种丰度大于5%的有肠杆菌目、乳杆菌目。在科水平上，细菌物种丰度大于5%的有肠杆菌、链球菌科。在属水平上，肠杆菌属是优势菌属。

图1 Illumina NovaSeq测序结果

2.3 小鼠致病性试验结果

感染小鼠8 h后，试验组开始有精神沉郁表现，食欲降低，肛门有稀粪，并开始出现死亡，病死率为80%。对照组小鼠精神状态与饮水采食均正常且无死亡现象。

2.4 剖检与病理组织学检测结果

剖检死亡小鼠可见肝脏、肺脏明显出血，肠道胀气，导致肠壁变薄（图2）。涂片镜检均可见病原菌，经鉴定发现分离到的菌株与所接种菌株一致。

病理组织学观察结果（图3）显示:心脏出现明显的心肌细胞纤维变性，肌间毛细血管出血，部分心肌纤维肌浆空泡化；肺组织出现肺泡壁断裂，肺泡塌陷，肺泡及间质充血、出血；肝细胞出现空泡变性，变性细胞胞浆淡染，其内出现大小不等微小空泡，胞核悬于中央或偏于一侧；门管区周围肝细胞呈片状坏死，坏死细胞结构模糊，胞质粉染，胞核固缩、碎裂或溶解。

2.5 诊疗结果

采用制剂一治疗后2周内，总体发病率从开始的42.3%降至18.8%（表1）。治愈率3组（白头翁散）＞1组（制剂一）＞4组（乳酸环丙沙星注射液）＞2组（母子安散）（表2）。

表1 驴（驹）发病数与发病率统计

表2 各处理治疗效果对比

3 讨论与结论

近几年，随着国家对发展草食畜牧业的大力支持，作为典型草食畜牧业的特色驴养殖得到迅速发展，逐渐从役用转向食用，但由于起步较晚，与其他畜禽规模化饲养场的精细饲养、生产效率仍有差距。本研究明确了目前从散养向规模化养殖过渡期危害驴场生产、导致经济损失最主要的疫病是细菌病，条件性致病菌是主要病原，发生率多数与驴舍环境、养殖密度、饲料质量和管理水平等有直接关系。检测结果发现病毒RNA含量中尾噬菌体目占比最高（27%），其次分别为疱疹病毒目（17%）、反转录病毒目（9%）、负链RNA病毒目（8%）、痘病毒科（7%）等，但只占总检出病原的2%。细菌病给驴的规模化养殖带来巨大的经济损失，规模化养殖条件下如何科学防控细菌病值得关注［4－9］。

综合在其他规模化驴场的采样分析，细菌性病原导致的腹泻在养殖场普遍发生，主要致病菌包括大肠杆菌、志贺氏菌等。其中大肠杆菌是引起肠炎和败血症的主要病原，也是引起驴驹严重腹泻、肺炎，造成驴驹大量死亡的原因，病死率为20%左右［10］。参照其他物种致病性大肠杆菌毒力因子的检测标准对驴源大肠杆菌进行分析，发现其没有K88、K99、937P等毒力基因，采用新的MLST分型方法对分离到的菌株进行分型，目前分离到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

随着驴产业的不断发展，现代规模化、集约化养殖越来越多，当前疫病的发生也表现出多类型、复杂性等特征。为此，首先要做好预防，加强日常的饲养管理工作，定期对养殖场所进行消毒，减少病菌的滋生环境和传播途径。严格按照《畜禽养殖场消毒技术》（NY/T3075—2017），做好不同生产环节的消毒工作，尤其是产房内部清洁和消毒工作［11－13］。为保证消毒效果，要对消毒后的理化指标、杀灭微生物效果指标和毒理学指标进行检验。

通过对当前细菌性传染病的防治方案疗效和发病率比对，发现药物疗效易发生变化，细菌极易发生耐药性，带菌现象迁延不愈。因此需要及时调整措施科学防治［14－16］。经过1年的用药效果分析发现，首选氨基糖甙类如卡那霉素、新霉素，配合喹诺酮类合成的环丙沙星、恩诺沙星等沙星类药物，而阿莫西林、头孢类的β－内酰胺类药物使用后有耐药性。抗生素可使用兽用硫酸卡那霉素注射液和乳酸环丙沙星注射液。必要时，服用蒙脱石、易蒙停或鞣酸蛋白等止泻剂。同时保证足够的奶水、维生素、氨基酸和盐离子，在控制住病原和腹泻症状后，使用短小芽孢杆菌与植物乳杆菌等驴源肠道的益生菌进行调理效果明显。

目前有关驴的疫病国内外研究较少，驴疫病相关的基础和应用研究薄弱，缺乏主要疫病的监测和系统的流行病学调查，疫病的流行规律不清、病原的致病性及变异机理不明，尚未建立重要疫病病原变异与传播的风险评估体系。本研究为驴场疫病的预防控制和净化措施等提供了数据支撑。