酚酸类化感物质介导病原真菌协同致害药用植物的研究进展

焦焕然，周冰谦，杨国红，卢恒，王晓，郭兰萍，刘伟

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）/山东省分析测试中心，山东 济南 250014；3.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700）

近十几年来，随着药用植物固定产地和长期单品种机械化连续种植，95%以上的常见栽培品种发生连作障碍，出现发育不良、病害加重的现象，如人参、太子参、三七、地黄、丹参等［1］。由此而引起的中药材产量、品质下降问题日趋严重，并制约了中药资源的可持续发展。

连作障碍的形成是植物、土壤、微生物等各种因素综合作用的结果，其中化感物质和土壤微生物群落及其与植物之间的反馈调节作用是近年来的研究热点。化感作用是植物在长期进化过程中形成的适应环境、提高生存竞争力的独特策略［2］，植物通过根系分泌物的方式产生化感物质［3］，在连作条件下，这些化感物质在土壤中逐渐积累，除直接抑制种子萌发和植物生长代谢、增加植株感病率外，还可为根际有害微生物生长提供重要的碳源和能量［4－6］，通过选择性促进病原微生物的增殖而间接致害植物。因此，化感物质和病原微生物之间可能存在着一定的协同致害作用。本文根据近年来的研究进展，分析总结酚酸类物质介导病原真菌产生协同致害作用的机理，旨在为进一步深入研究连作障碍形成机理及消减策略、促进中药材产业可持续发展提供理论依据。

1 酚酸类化感物质及其对植物的影响

化感物质来源于植物分泌物和腐解物，常见的化感物质有酚酸类、萜类、甾体类、生物碱类和产氰苷类等［7］。其中酚酸类物质已被证明是单一连作体系中活性较强的化感物质［8］，主要分为羟基肉桂酸、羟基苯甲酸以及类黄酮类。研究表明，连作障碍与土壤中酚酸类化感物质的积累密切相关［9］。其致害作用表现为抑制种子萌发和幼苗生长，破坏根系及其他分生组织［10，11］，影响光合作用、细胞膜通透性、代谢途径和生理抗性等［12－14］。酚类的细胞毒性主要与氧化还原循环过程中产生的自由基有关，酚酸通过形成半醌自由基后经过一系列反应作用于蛋白质、核酸和脂类等生物大分子，导致细胞结构和功能受损，代谢紊乱［15］。

2 病原真菌侵染对植物的影响

真菌是连作后根腐病和枯萎病等常见病害的主要病原体，包括镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、柱孢菌、疫霉菌等［14］。病原真菌的大量繁殖和侵染分泌的果胶酶、纤维素酶以及β－葡萄糖苷酶等细胞壁降解酶破坏了宿主植物细胞膜中间层，造成细胞内的侵填体、果胶以及胶状物质阻塞导管，阻碍水分运输。另一方面，病原菌生长过程中分泌的胞外毒素改变了细胞质膜的透性，对原生质体造成伤害，从而引起植株代谢紊乱，导致植物患病［16－18］。除此之外，病原菌侵染还能够激发植物免疫系统，以超敏反应（HR）使细胞程序性死亡［19］。这些生理变化，为病原菌的大量定殖创造了条件。

3 连作条件下酚酸介导病原真菌产生协同致害作用

研究表明，酚酸类化感物质介导病原真菌产生致害作用加剧了连作障碍的发生。齐永志［20］发现对羟基苯甲酸与尖孢镰刀菌同时处理比两因子单独处理对植株生长的抑制作用更明显，细胞膜受伤害程度加剧，并且对羟基苯甲酸使根系更易受到尖孢镰刀菌侵染。Ye等［21］以0.25 mmol/L肉桂酸＋尖孢镰刀菌、0.25 mmol/L肉桂酸和尖孢镰刀菌分别处理植株幼苗，发现两因素同时处理明显降低了生物量、气体交换参数和光合指标，植物更快出现维管束褐变和萎蔫。这些结果表明连作条件下酚酸和病原真菌之间存在额外或者协同的作用。根据近年来的研究，协同效应可以从以下几个方面解释。

3.1 连作条件下化感物质驱动微生物群落重构

植物根可向根际释放高达20%的光合产物［22］，这些物质可能成为微生物的营养碳源、氮源或信号刺激物［23］，通过吸引或排斥特定微生物驱动植物特有微生物群落的重构［24］。土壤微生物群落通过参与矿物营养循环、有机质周转、土壤结构形成和毒素去除等关键生化过程，影响土壤和植物［25］。Li等［26］推测，连作植物根系多年重复释放相同类型的物质，导致利用这些物质的微生物大量定殖，从而驱动了根际微生物群落结构变化，影响连作条件下的植物生长。

连作土壤最明显的改变是细菌的相对丰度下降，真菌的相对丰度升高，土壤从“细菌型”转变为“真菌型”［27］。Shi等［28］通过高通量DNA测序技术分析了连作0、3、6、9年百合根际土壤样品，结果表明长期连作显著提高了土壤真菌群落的多样性和丰度，高度丰富的致病真菌属的积累和有益真菌属的减少加剧了百合的连作障碍。长期连作破坏了枸杞根际细菌群落的功能和活性，增强了病原真菌在根际的定殖，链格孢属（Alternaria）、镰孢菌属（Fusarium）、赤霉菌属（Gibberella）和匍柄霉属（Stemphylium）等病原真菌属的群落丰度和多样性增加［29］。连作导致白术根际更高的真菌多样性，根霉菌属（Rhizopus）、产紫青霉菌（Penicilliumpurpurogenum）、链格孢属、Mycosphaerellapunctiformis等病原真菌明显增加［30］。丹参连作使根际土壤真菌在界、纲及属不同分类水平上均有较大变化，真菌的多样性随着连作年限的增加呈先下降后上升的趋势，连作两年后拟隐孢壳属（Cryptosporiopsis）、指状菌属（Dactylaria）、树粉孢属（Oidiodendron）等致病真菌成为优势菌属［31］。

研究发现，酚酸处理可以显著降低太子参根际有益菌木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）的相对丰度，并增加有害菌如镰孢菌属、篮状菌属（Talaromyces）、小被孢霉属（Mortierella）、拟青霉属（Paecilomyces）和支顶孢属（Acremonium）的相对丰度［32］。在非连作土壤中添加外源苯甲酸后，土壤中病原真菌相对丰度升高，如镰孢菌属、生赤壳属、绿僵菌属等［33］。在连作地黄根际检测到5种酚酸（4－羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、3，4－二羟基苯甲酸和香草醛）浓度升高的土壤中，细菌多样性指数、真菌多样性指数和真菌均匀度指数均显著升高，潜在病原菌增加［34］。以上结果说明，连作条件下以酚酸为代表的化感物质驱动微生物群落变化，一方面，这些病原微生物可能侵染植物，另一方面，由于微生物群落的失衡使植物防御机制更易突破，增加土传病害的发生［35］。

3.2 酚酸类化感物质对病原真菌的诱导增殖

与植物个体相比，病原菌对酚酸类物质及其浓度更敏感，当土壤中酚酸类物质对植物还未达到致害浓度时，微生物区系结构已经开始发生变化［36］。Tian等［37］研究发现枯萎病的发生与酚酸及其浓度密切相关，酚酸诱导病原真菌的增殖进而引发病害。

酚酸对病原菌的诱导增殖作用有两大原因:一是可直接为病原真菌提供营养物质，从而促进病原菌增殖或孢子萌发，造成土传病害的加剧；二是通过降低植株保护酶活性及抗氧化系统抗性，增加根系的活性氧自由基含量及加重膜脂过氧化程度，造成植物本身营养元素的泄漏，从而对病原菌的生长产生刺激作用。如地黄的根系分泌物阿魏酸可以为根际尖孢镰刀菌提供碳源［38］，使病原菌具有良好的繁殖条件，并减弱或消除某些有益菌的拮抗作用，从而使得病原菌数量不断增加；土壤实测浓度的根皮苷、香草酸、根皮素、苯甲酸、水杨酸及5种酚酸混合物可加快病原真菌串珠镰孢菌和尖孢镰刀菌的菌丝分裂速度［39］；香兰素、阿魏酸及其混合物可以显著促进地黄根际尖孢镰刀菌的菌丝生长、孢子形成和毒素的产生［40］，这与阿魏酸、对羟基苯甲酸、丁香酸和肉桂酸处理可促进太子参根际病原真菌生长、提高产孢量和孢子萌发率的结论一致［41］。病原菌孢子的萌发和菌丝的生长是病原菌进行侵染和致病寄主植物的前提。

酚酸类物质诱导病原真菌增殖的分子机制目前尚不明确。舒阳［38］发现阿魏酸能够促进尖孢镰刀菌的生长繁殖以及产色素、毒素等次级代谢相关蛋白的表达，并锁定与阿魏酸互作的镰刀菌蛋白，即14－3－3蛋白和谷胱甘肽－S转移酶（glutathione S－transferase，GST）蛋白。其中14－3－3蛋白参与转运与毒素合成相关的转录因子到特定DNA序列，可激活相关信号通路，调控下游基因的表达；GST蛋白的主要功能是解毒，尖孢镰刀菌可能通过GST蛋白来降低阿魏酸毒性后作为营养物质加以利用。李振方［42］研究发现地黄分泌的化感物质对羟基苯甲酸和阿魏酸通过增强真菌信号转导系统如SH3结构、F－box蛋白体系和分子伴侣等修饰原件，增强了对真菌营养代谢和基因表达过程的调控，促进真菌对营养物质的利用。另外，酚酸增加了病原真菌的H＋外排和质膜H＋－ATPase活性，为病原菌的大量增殖提供了有利的酸性环境［33］。通过这些研究结果推测，酚酸诱导病原真菌增殖的作用机制可能与影响病原菌的代谢通路和基因表达有关。

酚酸类化感物质对病原菌的促进效应受浓度的影响，一般表现为低浓度促进，高浓度抑制。当阿魏酸浓度小于100 mg/L时，对尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子萌发的促进作用随浓度升高而增强，当浓度大于100 mg/L时，则随着浓度的增加抑制性急剧增加［43］；没食子酸、对羟基苯甲酸、香兰素酸和苯甲酸在低浓度下促进太子参根际病原菌KosakoniasacchariW.的生长，但在高浓度下抑制其生长［44］；人参根际土壤中的没食子酸、苯甲酸、3－苯基丙酸、肉桂酸对人参锈腐菌的生长也表现出低促高抑的作用［45］。具有这种浓度效应的酚酸还有绿原酸、紫丁香酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸［46］等，不同的酚酸对病原菌从低浓度促进到高浓度抑制的转折点是不同的。有研究发现一些酚酸在低浓度时对病原真菌的菌丝生长有一定的抑制作用［47］，但是酚酸总体上对真菌还是起到促进作用，并且大多在植物根际土壤中含量比较低。

3.3 酚酸类物质促进病原真菌毒素释放

酚酸类物质还可通过促进病原菌分泌毒素和胞外酶等手段，改变植物组织结构，使病菌更易侵入寄主。真菌毒素被认为是多种植物枯萎病的致病因子，前人研究已经证实阿魏酸以浓度依赖的方式促进真菌毒素的产生［48］；丁香酸也被证明可以刺激真菌毒素在液体培养中的产生，处理组霉菌毒素的产量与对照组相比升高了60.9%～561.5%［49］。太子参根际病原菌TalaromyceshelicusM.经过混合酚酸处理后，3A－DON和15ADON两种毒素产量急剧增加，对植物产生毒害作用，并促进其它病原真菌的生长，抑制有益细菌短小芽孢杆菌的生长，使土壤环境恶化［44］；添加外源低浓度芥子酸在刺激真菌毒素生成和积累的同时，还使果胶酶、蛋白酶、淀粉酶活性提高，破坏宿主细胞壁和防御体系［50］。以上研究结果表明，酚酸促进了病原真菌毒素释放，增加了病原体感染和入侵的风险，加重了对宿主植物的损害。

3.4 病原真菌加剧化感物质的毒性

在土壤中，化感物质暴露于各种物理、化学和生物过程中，它们可能被解毒，也可能成为土壤生物生产新毒素的碳骨架［51］。研究表明，土壤病原真菌在利用酚酸的同时，酚酸也很容易通过病原菌转化为另一种具有不同植物毒性的物质［52］。例如阿魏酸常被微生物转化为香草酸［53］；对羟基苯甲酸的含量随着对香豆酸的迅速减少而增加［54］；病原菌KosakoniasacchariW.能够利用香兰素产生一种中间产物原儿茶酸，而原儿茶酸对土壤中有益的短小双歧杆菌的生长有负面影响［55］。研究表明地黄产生的4种酚酸的混合物对幼苗的抑制作用比每种单一酚酸更强［35］，不同酚酸之间也存在着协同作用［56，57］。

Gu等［58］将健康和病原菌感染的植株分泌物添加到未施肥的土壤中，发现病原菌的存在改变了酚类化合物的分泌，增加了咖啡酸的释放，并且受感染植物的分泌物导致土壤微生物多样性降低。同样，有研究报道在尖孢镰刀菌侵染太子参后，参与苯丙酸生物合成途径的关键酶基因如PAL和CCoAOMT基因表达上调，有利于酚酸类化合物的合成，C4H、C4L和CAD基因表达下调，抑制了酚酸类化合物的降解［19］。这一结果表明，一些酚酸化合物可能是在植物感染病原菌后积累起来的［59］，病原真菌的感染可能增加了酚酸类物质的合成途径。并且，由于微生物群落的改变，能够降解有毒化合物的细菌数量的减少也导致了有毒化合物在土壤中的积累［60］。因此，通过病原真菌对酚酸的转化和积累，土壤中酚酸的含量逐渐升高，毒性增强，多样性增加。

4 问题与展望

虽然化感物质对植物的致害作用不容忽视，但是考虑到酚酸很容易被微生物降解，连作障碍的主要元凶可能不是在土壤中检测到的残留酚酸，微生物利用酚酸产生的一系列反应才是化感作用的核心。本文重点总结了酚酸类物质介导病原真菌产生协同致害可能的原因，即化感物质选择性驱动微生物群落改变，诱导病原真菌增殖和毒素释放，在对植物造成生物胁迫的同时加剧了化感物质的毒性，进一步对植物造成损伤。

目前化感物质介导病原真菌产生协同致害作用的研究还停留在实验室阶段，大多数只能通过体外培养来证明其相互作用，在真实的田间环境中，植物、土壤、微生物各种因素更加复杂，根际生态系统中特定微生物的功能有待验证，如何更加直接地表征微生物对化感物质的利用及代谢是未来需要进一步深入研究的问题。另外，关于协同作用的分子机制研究不够深入且系统，基因测序、转录组学和蛋白组学技术是当前研究的主要手段，分子研究能够较好地明晰植物与根际微生物所需的植物转运蛋白，然而目前仍然有大多数信号分子的转导通路未被探索，对于其中涉及的细胞、生化和转录变化目前知之甚少。

中药材是中医药事业传承和发展的物质基础，连作障碍导致的产量降低、品质变劣、病虫害加重等问题日益突出，连作障碍的发生是植物、微生物和土壤之间复杂的、循环的相互作用结果，而不仅仅是单一因素的作用。运用分析化学、细胞生物学和分子生物学等方法阐明这些生物学过程，将对消减和克服连作障碍、保证临床用药的安全性、有效性和稳定性具有重要意义。