LncRNA LINC00261靶向miR-182-5p对脑胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的影响及其机制

陈彬 徐廷伟

(湖北文理学院附属医院 襄阳市中心医院神经外科，湖北 襄阳 441021)

脑胶质瘤是一种比较常见的原发性颅脑肿瘤，其由大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生。因其为不能完全切除的原发性脑肿瘤，因此无法完全治愈。临床常用的标准治疗包括手术、放射治疗和化疗〔1，2〕。尽管进行了这种强化治疗，但肿瘤的耐药性和复发限制了其疗效〔3，4〕。替莫唑胺(TMZ)是胶质瘤化疗标准的烷基化剂。甲基转移酶(MGMT)启动子高甲基化是胶质瘤对TMZ产生耐药性的机制之一〔5〕。尽管患者生存期得到延长，但治疗效果有限，因为胶质瘤往往在治疗过程中对TMZ表现出适应性耐药。因此，针对耐药胶质瘤的治疗具有重要的临床治疗意义。人类基因组中仅有不到2%编码成蛋白质，超过90%的基因组转录为非编码RNA〔6〕。LncRNA被定义为一类长度超过200个核苷酸(nt)的非编码RNA转录本，其不具有完整的开放阅读框。有证据表明，LncRNA在多种生物学过程中发挥作用，包括癌细胞的耐药〔7，8〕。 LncRNA LINC00261参与多种癌症的耐药性调控〔9〕，但是其在脑胶质瘤中是否对耐药性具有调控作用尚且未知。本研究拟以胶质瘤细胞U251为研究对象，观察LINC00261对其TMZ耐药性的影响，旨在探讨LINC00261增强TMZ耐药胶质瘤细胞对TMZ敏感性的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 组织标本收集于襄阳市中心医院2018年3月至2019年6月外科手术切除的脑胶质瘤标本20例，脑外伤内减压切除的正常脑组织20例。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书；胶质瘤细胞U251购自中国科学院细胞库；胎牛血清(FBS)购自四季青；DMEM培养基购自上海联硕生物公司；替莫唑胺购自山东中天；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购自Sellect公司；RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司；Transwell小室均购自Corning公司；LipofectamineTM2000试剂、电化学发光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 胶质瘤细胞株U251的培养：含有10% FBS的DMEM培养基，37℃，5%CO2的细胞培养箱中常规培养，传代。

1.2.2细胞分组与处理 将正常培养的U251细胞标记为U251组。将U251细胞按照陆芩等〔10〕的浓度梯度法建立TMZ耐药U251细胞，标记为U251/TMZ组。将TMZ(5、10、20、40、80 μg/ml)处理U251、U251/TMZ细胞48 h，分被标记为5、10、20、40、80 μg/ml组，从中筛选最适浓度10 μg/ml用于后续试验。用脂质体LipofectamineTM2000试剂，加入4倍DNA或质粒体积的脂质体，将pcDNA、pcDNA-LINC00261、anti-miR-NC、anti-miR-182-5p、pcDNA-LINC00261+miR-NC、pcDNA-LINC00261+miR-182-5p转染至U251/TMZ细胞，转染4 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，并用10 μg/ml TMZ处理48 h，用qRT-PCR法检测转染的效率，确定转染成功后，分别标记为TMZ+pcDNA组、TMZ+pcDNA-LINC00261组、TMZ+anti-miR-NC组、TMZ+anti-miR-182-5p组、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC组、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p组，用于后续试验。将miR-NC、miR-182-5p、si-NC、si-LINC00261用同样的方法转染至U251细胞，分别标记为miR-NC组、miR-182-5p组、si-NC组、si-LINC00261组。

1.2.3qRT-PCR法检测细胞中LINC00261、miR-182-5p的表达 收集细胞，用RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒获得cDNA。再用qRT-PCR试剂盒检测各个样品中LINC00261、miR-182-5p的表达，以GAPDH、U6为内参，2-△△Ct计算LINC00261、miR-182-5p的相对表达。引物信息：LINC00261上游引物5′-ACATTTGGTAGCCCCTGGAG-3′，下游引物5′-TCTTCCCCGGAGAACTAGCA-3′；miR-182-5p上游引物5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GADPH上游引物5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′，下游引物5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。

1.2.4MTT法检测细胞抑制率 收集细胞，调整至5×105个/ml，取100 μl接种至96孔板，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养4 h。尽量弃去上清，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，震荡混匀至结晶紫溶解。调整酶标仪至490 nm波长，检测细胞的吸光度(A)。细胞的抑制率=〔1-A490样品/A490对照〕×100%。

1.2.5Transwell小室检测细胞迁移侵袭 选用含有基质胶的Transwell小室进行细胞的侵袭检测，不含基质胶的Transwell小室进行细胞的迁移检测，二者的操作步骤相同。操作步骤为：先将细胞用无血清培养基培养24 h，收集细胞，调整至5×106个/ml。取200 μl细胞加入小室的上室内，取600 μl含血清的培养基加入小室的下室，将小室置于培养箱中培养48 h。准备甲醇固定液和结晶紫染色液备用。小心取出小室，用棉签轻轻拭去聚碳酸酯膜上表面的细胞，然后将膜转移至固定液中，30 min。将膜浸入染色液中染色15 min，用镊子轻轻将膜下表面朝上在载玻片上固定。用显微镜观察细胞的数量(×200)，取平均值。

1.2.6Western印迹检测细胞中细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21的蛋白表达 收集细胞并用含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液裂解，提取用蛋白后用BCA法进行蛋白定量，再用沸水浴10 min行变性处理。小心加样后，调节电压60 V进行稳压电泳，约40 min，电压调整至120 V进行稳压电泳，1.5～2.0 h结束。结束后，将蛋白用转膜仪湿转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，转膜过程需要低温环境下操作。转膜结束后进行脱脂奶粉(5%)封闭、一抗孵育(兔抗人多克隆抗体CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21)、二抗孵育(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体)。将膜转移至暗室内，用ECL试剂进行显影、定影、曝光，用Quantity One凝胶分析软件分析条带的灰度值，以GAPDH为内参，目的条带灰度值与内参灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。

1.2.7生物信息学预测 通过在线靶基因预测库Target Scan(http：//www.targetscan.org/)预测LINC 00261的靶向结合位点。

1.2.8双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中LINC00261与miR-182-5p的结合能力 收集细胞，裂解液将细胞充分裂解，再加入5 μl的荧光素酶缓冲液和底物，混合均匀后测量荧光强度，再加入海参荧光素酶缓冲液和底物，混匀检测海参荧光强度。实验重复3次，每个样本做3个复孔。最后比较海参荧光素酶的强度，表达LINC00261与miR-182-5p的结合能力。值得注意的是，实验中以为psiCHECK2载体，萤火虫荧光素酶为内参，psiCHECK2-LINC00261-野生型(WT)+miR-NC、psiCHECK2-LINC00261-突变型(MUT)+miR-NC为对照，观察miR-182-5p对LINC00261表达的影响。

1.3统计学方法 采用GraphPad Prism6.0进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1LINC00261和miR-182-5p在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达 见表1，与正常脑组织相比，胶质瘤组织中LINC00261表达显著降低，miR-182-5p表达显著升高(均P<0.001)。

2.2LINC00261和miR-182-5p在胶质瘤细胞和胶质瘤TMZ耐药细胞中的表达 见表2，与U251组相比，U251/TMZ组细胞中LINC00261表达显著降低，miR-182-5p表达显著升高(均P<0.001)。

2.3不同浓度替莫唑胺对胶质瘤细胞和胶质瘤替莫唑胺耐药细胞抑制率的影响 结果如表3所示，与U251组相比，U251/TMZ组细胞在替莫唑胺浓度为5、10、20、40、80 μg/ml的抑制率均显著降低，IC50值显著升高(P<0.05)。

表1 LINC00261和miR-182-5p在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达

表2 LINC00261和miR-182-5p在胶质瘤细胞和胶质瘤TMZ耐药细胞中的表达及不同浓度TMZ对胶质瘤细胞和胶质瘤TMZ耐药细胞抑制率的影响

2.4LINC00261过表达联合TMZ(10 μg/ml)对U251/TMZ细胞增殖、迁移侵袭的影响 与TMZ+pcDNA组相比，TMZ+pcDNA-LINC00261组细胞中LINC00261表达显著升高，细胞抑制率显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著降低，p21蛋白表达显著升高(均P<0.001)。见图1、表3。

2.5抑制miR-182-5p表达联合TMZ对U251/TMZ细胞增殖、迁移侵袭的影响 与TMZ+anti-miR-NC组相比，TMZ+anti-miR-182-5p组细胞中miR-182-5p表达显著降低，细胞抑制率显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著降低，p21蛋白表达显著升高(均P<0.001)。见图2、表4。

A：增殖、迁移侵袭相关蛋白表达；B：U251/TMZ细胞的迁移侵袭(结晶紫，×200)；图2同

表3 LINC00261过表达联合TMZ对U251/TMZ细胞增殖、迁移侵袭的影响

图2 抑制miR-182-5p表达联合替莫唑胺对U251/TMZ细胞增殖、迁移侵袭的影响

表4 抑制miR-182-5p表达联合替莫唑胺对U251/TMZ细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.6LINC00261靶向调控miR-182-5p的表达 通过在线预测软件target scan预测到LINC00261与miR-182-5p之间存在互补的结合位点(图3)。

图3 LINC00261的序列中含有与miR-182-5p互补的核苷酸序列

与miR-NC组相比，miR-182-5p组WT-LINC00261细胞的荧光活性显著降低(表5)。与pcDNA组(1.00±0.09)相比，pcDNA-LINC00261组细胞中miR-182-5p表达(0.41±0.08)显著降低，与si-NC组(0.98±0.08)相比，si-LINC00261组细胞中miR-182-5p表达显著升高(2.35±0.23；F=353.756，P=0.000)。

表5 双荧光素酶报告实验

2.7miR-182-5p过表达逆转了INC00261过表达对U251/TMZ细胞TMZ耐药性的作用 与TMZ+pcDNA组相比，TMZ+pcDNA-LINC00261组细胞中miR-182-5p表达显著降低，细胞抑制率显著升高，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著降低，p21蛋白表达显著升高；与TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC组相比，TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p组细胞中miR-182-5p表达显著升高，细胞抑制率显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著升高，p21蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表6、图4、图5。

表6 miR-182-5p过表达逆转了INC00261过表达对U251/TMZ细胞TMZ耐药性的作用

图4 U251/TMZ细胞的迁移侵袭(结晶紫，×200)

1～4:TMZ+pcDNA、TMZ+pcDNA-LINC00261、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-NC、TMZ+pcDNA-LINC00261+miR-182-5p

3 讨 论

化疗是癌症的基本治疗手段之一，然而，临床治疗失败的主要原因是化疗耐药的产生。药物外排、DNA损伤修复、细胞凋亡、靶基因突变等多种因素相互作用，导致耐药机制复杂〔11〕。LncRNA一直是生物科学领域的研究热点，最新研究表明，LncRNAs在乳腺癌、胃癌、肺癌等肿瘤的耐药性中发挥着重要作用〔12〕。LINC00261是一种LncRNA，其在肿瘤抑制中发挥重要作用〔13〕。Shi等〔14〕在非小细胞肺癌的研究中报道，LINC00261在癌组织中的表达异常下调，并与患者的预后差呈正相关，在癌细胞中过表达LINC00261能够抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，深入研究发现，LINC00261可靶向抑制LINC00261，抑制Wnt信号通路的活性进而参与非小细胞肺癌的致病机制。Lin等〔15〕在研究中报道，抗氟尿嘧啶的食管癌中LINC00261表达降低，过表达LINC00261的氟尿嘧啶耐药食管癌细胞中，细胞的增殖受到明显抑制，凋亡能力明显提升，沉默LINC00261的氟尿嘧啶耐药食管癌细胞则可增强癌细胞的增殖和抗凋亡能力，这提示LINC00261可能成为治疗耐药食管癌的新靶点。我们推测LINC00261可能也参与抗癌药物TMZ在胶质瘤中的耐药性调控。本研究通过RT-qPCR法检测了胶质瘤组织、胶质瘤细胞、TMZ耐药胶质瘤细胞中LINC00261的表达，发现LINC00261在胶质瘤中表达异常下调，在耐药胶质瘤细胞中的表达下调更明显，可见，LINC00261在耐药胶质瘤中的表达情况与其在氟尿嘧啶耐药食管癌中的表达情况相类似。进一步研究，用MTT、Transwell小室、Western印迹实验检测过表达LINC00261的TMZ耐药胶质瘤细胞的抑制率、迁移侵袭及相关蛋白表达，发现过表达LINC00261可提高耐药癌细胞的抑制率，抑制耐药癌细胞的迁移侵袭，下调CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达，上调p21蛋白表达，可见，过表达LINC00261能够增强TMZ耐药胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。深入研究，通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测实验发现，LINC00261可靶向负调控miR-182-5p，推测LINC00261增强TMZ耐药胶质瘤细胞的敏感性的机制可能与miR-182-5p具有相关性。

miRNA在人类多种疾病中通过抑制靶基因的转录或蛋白翻译参与疾病的发生发展过程〔16，17〕。Xue等〔18〕在胶质瘤的研究中发现，STAT3的异常激活或表达降低分别促进或抑制miR-182-5p的表达，并且肿瘤抑制因子procadadherin-8(PCDH8)是miR-182-5p的候选靶基因，胶质母细胞瘤组织中PCDH8的表达水平与磷酸化信号传导与转录激活因子(p-STAT)3或miR-182-5p呈负相关，说明miR-182-5p在胶质瘤中发挥促进癌症恶化的作用。Cao等〔19〕在肝癌的研究中报道，miR-182-5p能够促进肝癌的恶性化进展，其机制与靶向叉头转录因子(FOX)O3a相关，推测miR-182-5p在胶质瘤中可能可靶向FOXO3a参与胶质瘤的进展过程。史俊英等〔20〕在胃癌的研究中发现，抑制miR-182-5p能够增强氟尿嘧啶耐药胃癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。本研究中检测了胶质瘤组织、胶质瘤细胞、替莫唑胺耐药胶质瘤细胞中miR-182-5p的表达，发现miR-182-5p表达明显上调，且抑制miR-182-5p能够明显的提高TMZ对耐药胶质瘤细胞的抑制率，增强TMZ对耐药胶质瘤细胞的抗迁移侵袭作用，可见，抑制miR-182-5p能够增强TMZ对耐药胶质瘤细胞的敏感性，这与抑制miR-182-5p在氟尿嘧啶耐药胃癌细胞中的增敏作用相似。重要的是，我们还发现，过表达miR-182-5p能够逆转LINC00261对TMZ耐药胶质瘤细胞抑制率、迁移侵袭的作用。这些研究结果为TMZ耐药胶质瘤的治疗提供了潜在的治疗靶点，遗憾的是，我们本在体内对这些结果进行更充分的验证。

综上所述，LncRNA LINC00261可逆转TMZ耐药胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性，其机制可能与靶向miR-182-5p有关，为耐药胶质瘤的治疗提供新方向。