白毛藤多糖通过调控miR-1270/CCNG2通路抑制肺癌细胞增殖、促进细胞凋亡的机制

王婷婷 郑学香 曾真 李婷婷

(湖北民族大学附属荆门市第一人民医院体检科，湖北 荆门 448000)

肺癌是全球癌症死亡的最主要原因。近年来，尽管肺癌的早期诊断和靶向治疗技术不断发展，但整体5年生存率仍然很低〔1〕。因此，开发新的有效的肺癌治疗方法迫在眉睫。顺铂是治疗肺癌的有效药物，但由于顺铂耐药性的出现导致肺癌患者预后不良〔2〕。最近，天然化合物的抗肿瘤作用引起了研究者的关注〔3〕。白毛藤为茄科植物白英的全草，具有清热利湿，祛风解毒之功效。研究发现，白毛藤多糖对乳腺癌〔4〕、胰腺癌〔5〕等恶性肿瘤具有抑制作用，但白毛藤多糖在肺癌中的作用鲜有报道。miR-1270是一种致癌基因，研究发现，miR-1270在膀胱癌等恶性肿瘤中表达上调，干扰其表达可抑制癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔6〕。细胞周期蛋白(CCN)G2是一种抑癌基因，研究发现，CCNG2在结肠癌组织中表达下调，过表达CCNG2抑制结直肠癌细胞的增殖〔7〕。有研究〔8〕报道，桑色素通过调控miR-135b/CCNG2表达抑制肺癌细胞的活力、克隆形成及迁移能力。但白毛藤多糖和miR-1270对肺癌细胞增殖、凋亡的影响及miR-1270和CCNG2的靶向关系，且白毛藤多糖是否通过调控miR-1270/CCNG2通路影响肺癌细胞的增殖和凋亡目前还尚未可知。本研究旨在揭示白毛藤多糖调控miR-1270/CCNG2通路对肺癌细胞增殖和凋亡的影响和机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 人肺癌细胞株A549购于美国ATCC；DMEM培养液购于Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；LipofectamineTM2000转染试剂购于Invitrogen公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购于碧云天公司；TRIzol试剂、膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒和Western印迹相关试剂购于北京索莱宝公司；miRNA抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、anti-miR-1270、pcDNA、pcDNA-CCNG2、miR-NC、miR-1270、野生型(WT)-CCNG2和突变型(MUT)-CCNG2构建和测序及PCR引物由北京华大基因公司提供；细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、p21抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、Bcl相关X蛋白(Bax)抗体和CCNG2抗体及二抗均购于Abcam公司。

1.2细胞培养和转染 人肺癌细胞株A549培养于含有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基液中，置于37℃、含5% CO2、湿度饱和的细胞培养箱中进行培养。将对数生长期的A549细胞按每孔2×105个细胞的密度接种于6孔板，利用LipofectamineTM2000将anti-miR-NC、anti-miR-1270、pcDNA和pcDNA-CCNG2分别转染A549细胞，培养48 h后检测转染效果，随后进行后续实验。

1.3实验分组 A549细胞分组如下：对照组(DMSO处理A549细胞)、白毛藤多糖组(分别用终浓度为0.4、0.8和1.6 mg/ml的白毛藤多糖处理A549细胞48 h)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-1270组(转染anti-miR-1270)、pcDNA组(转染pcDNA)和pcDNA-CCNG2组(转染pcDNA-CCNG2)、白毛藤多糖+miR-NC组(转染miR-NC后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖处理48 h)和白毛藤多糖+miR-1270组(转染miR-1270后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖处理48 h)。

1.4MTT实验 取按照1.3分组进行相应处理的各组对数期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，按照每孔100 μl接种于96孔板，培养48 h后，加入20 μl的MTT溶液继续培养4 h，弃去培养液，加入150 μl的二甲基亚砜，振荡10 min，当结晶溶解后，用酶标仪测定各孔490 nm波长处的吸光度值(A值)。根据A值计算细胞抑制率(IR)，IR(%)=(对照组A-实验组A)/(对照组A-空白组A)×100。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 分别收集按照1.3分组处理至规定时间的A549细胞，离心后弃去上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬A549细胞后，再次离心弃去上清液。用适量的1×结合缓冲液重悬A549细胞，使其浓度约1×105个/ml，每管加入100 μl细胞悬液，加入5 μl的Annexin V-FITC，混匀后，再加入10 μl的PI，室温避光孵育15 min后，加入400 μl的1×结合缓冲液混匀后，用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。

1.6qRT-PCR检测 利用TRIzol试剂分别提取各组A549细胞的总RNA，检测其浓度和纯度。利用逆转录酶合成cDNA后，进行qRT-PCR扩增。分别以U6和GAPDH为内源性参照，用2-ΔΔCt法计算miR-1270和CCNG2 mRNA的相对表达量。实验用引物序列：miR-1270上游引物5′-CTGGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′，下游引物5′-TGCAAAGAGCCACATAGAAGAT-3′，U6上游引物5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，下游引物5′-CTGCTTCATGA-TCGTTGTTGCTTG-3′，CCNG2上游引物5′-CTTTGGGCATTATTAGGA-3′，下游引物5′-GAGGAGGAAACAGTAGCAG-3′，GAPDH上游引物为5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAA-C-3′，下游引物为5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。

1.7Western印迹检测 利用RIPA裂解液裂提取各组A549细胞的总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度。按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-电化学发光(ECL)显色步骤进行，最后利用Image J 软件对目的条带灰度值进行分析。

1.8双荧光素酶报告基因检测 利用生物信息软件预测miR-1270的靶基因。发现miR-1270与CCNG2的3′UTR存在部分连续结合位点，猜测CCNG2是miR-1270的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因实验进行验证。构建WT-CCNG2和MUT-CCNG2的CCNG2-3′UTR荧光素酶报告基因载体，利用LipofectamineTM2000将miR-1270模拟物和miR-NC分别与WT-CCNG2和MUT-CCNG2共转染A549细胞，培养48 h后，测定各组人胃腺癌细胞(AGS)细胞的荧光素酶活性。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1白毛藤多糖对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响 与对照组相比，白毛藤多糖组A549细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，随着白毛藤多糖浓度增加，对A549细胞的增殖抑制和凋亡促进作用显著增强，各浓度组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1、图2。

表1 白毛藤多糖对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

图1 细胞凋亡流式图

图2 白毛藤多糖对肺癌A549细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响

2.2白毛藤多糖对肺癌A549细胞中miR-1270和CCNG2表达的影响 与对照组相比，白毛藤多糖组A549细胞中miR-1270的表达显著降低，CCNG2 mRNA和CCNG2蛋白的表达显著增加(P<0.05)。随着白毛藤多糖浓度增加，对miR-1270表达的抑制和CCNG2表达的促进作用明显增强，各浓度组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、表2。

图3 CCNG2蛋白表达

表2 白毛藤多糖对肺癌A549细胞中miR-1270和CCNG2表达的影响

2.3miR-1270靶向调控CCNG2的表达 miR-1270的5′端与WT-CCNG2的3′UTR存在部分特异性结合为位点。见图4。

图4 CCNG2的3′UTR中含有与miR-1270互补的核苷酸序列

如表3所示，当上调miR-1270表达后，转染WT-CCNG2的3′UTR的荧光素酶报告基因载体的A549细胞的荧光素酶活性显著下降(P<0.05)，而转染MUT-CCNG2的3′UTR的荧光素酶报告基因载体的A549细胞的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。当上调miR-1270表达后，A549细胞CCNG2蛋白的表达显著降低〔miR-NC组(0.64±0.06)vs miR-1270组(0.25±0.03)，P<0.05〕；当下调miR-1270表达后，A549细胞CCNG2蛋白的表达显著升高〔anti-miR-NC组(0.63±0.06)vs anti-miR-1270组(0.97±0.09)，P<0.05〕。以上结果表明，CCNG2是miR-1270的靶基因，miR-1270可负性调控CCNG2的表达。见图5。

表3 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组，miR-1270组，anti-miR-NC组，anti-miR-1270组

2.4抑制miR-1270表达对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响 与anti-miR-NC组相比，anti-miR-1270组A549细胞miR-1270的表达显著降低(P<0.05)，表明稳定抑制miR-1270表达的A549细胞株构建成功。与anti-miR-NC组相比，anti-miR-1270组A549细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率显著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表达显著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表达显著升高(均P<0.001)，见图6、表5。表明，抑制miR-1270表达可抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡。

图6 anti-miR-NC组与anti-miR-1270组增殖凋亡相关蛋白表达

表5 抑制miR-1270表达对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

2.5CCNG2过表达对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响 与pcDNA组相比，pcDNA-CCNG2组A549细胞CCNG2蛋白的表达显著升高(P<0.001)，表明过表达CCNG2的A549细胞株构建成功。与pcDNA组相比，pcDNA-CCNG2组A549细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表达显著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表达显著升高(均P<0.001)，见图7、表6。表明，CCNG2过表达可抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡。

2.6miR-1270过表达逆转了白毛藤多糖对肺癌A549细胞增殖和凋亡的作用 与对照组比较，白毛藤多糖组A549细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著增加，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表达显著降低，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表达显著升高；与白毛藤多糖+miR-NC比较，白毛藤多糖+miR-1270组A549细胞增殖抑制率和细胞凋亡率显著降低，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表达显著升高，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表达显著降低(均P<0.001)。表明，过表达miR-1270逆转了白毛藤多糖对肺癌A549细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。见表7、图8。

图7 CCNG2和增殖、凋亡相关蛋白表达

表6 CCNG2过表达对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

表7 miR-1270过表达逆转了白毛藤多糖对肺癌A549细胞增殖和凋亡的作用

1～4：对照组，白毛藤多糖组，白毛藤多糖+miR-NC组，白毛藤多糖+miR-1270组

3 讨 论

肺癌是由癌细胞的增殖失控引起的复杂疾病，癌基因的过度表达和抑癌基因的功能丧失是导致肺癌发生发展的主要原因〔9〕。尽管化疗对肺癌等实体瘤具有显著的临床活性，但固有和获得性耐药的出现大大降低了化疗药物的应用〔10〕。因此，从天然化合物中寻找一种经济、安全、高效的抗癌药物是抗癌药物研发的主要目标。

白毛藤作为我国一种传统中药，具有抗炎、抗菌、抗过敏、肝脏保护、增强免疫力和抗肿瘤等多种药理活性〔11〕。白毛藤参与调控多种恶性肿瘤的发生发展。Lin等〔12〕在研究白毛藤提取物的体外抗癌分子机制时发现，白毛藤提取物可促使骨肉瘤细胞形态学改变，抑制细胞存活，并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。Liu等〔13〕研究发现白毛藤总皂苷对宫颈癌细胞Hela具有增殖抑制作用，并通过多途径诱导Hela细胞凋亡。此外，白毛藤提取物还可显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，促进脾细胞增殖，增强自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CTL)活性，改善免疫反应进而表现出抗肿瘤活性〔14〕。本研究中通过体外细胞实验发现，白毛藤多糖可显著抑制A549细胞的增殖，促进细胞凋亡。同时，发现白毛藤多糖可显著抑制A549细胞中miR-1270的表达，促进CCNG2的表达。此外，本实验结果表明miR-1270可负性调控CCNG2的表达。推测白毛藤多糖通过调控miR-1270/CCNG2通路而发挥作用。

miR-1270是一种保守性较差的miRNA。研究证实，miR-1270可以与干扰素α1和其性质的反义mRNA的相互作用以调节体内稳态〔15〕。此外，miR-1270在恶性肿瘤的发生发展中也起重要作用。Zhong等〔16〕研究发现，miR-1270在骨肉瘤组织和细胞中高表达，通过慢病毒技术干扰miR-1270表达可抑制骨肉瘤细胞的体外增殖和迁移，且miR-1270高表达与诊断时患者的远处转移和高级别肿瘤显著相关。Yi等〔17〕研究表明，miR-1270在甲状腺癌细胞系和组织中异常上调，miR-1270通过靶向调控SCAI表达促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移和体内移植。在肺癌中，miR-1270被认为与表观遗传调节因子组蛋白去乙酰化酶(HDAC)4相关〔18〕，但关于miR-1270在肺癌中作用机制并未有详细报道。CCNG2作为一种肿瘤抑制因子，具有调节细胞生长和增殖的作用，其表达量的降低与多种恶性肿瘤类型有关〔19〕。Gao等〔20〕研究发现，胃癌组织中CCNG2表达水平降低，且与肿瘤大小、迁移和分化状态差有关，过表达CCNG2抑制了肿瘤的生长和转移。CCNG2在甲状腺癌组织也呈低表达，过表达CCNG2能够抑制甲状腺癌SW579细胞的增殖并促进其凋亡〔21〕。本研究证实抑制miR-1270或过表达CCNG2均可显著抑制A549细胞的增殖，促进细胞凋亡，过表达miR-1270逆转了白毛藤多糖对肺癌A549细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，表明在肺癌细胞中，白毛藤多糖通过调控miR-1270/CCNG2通路而发挥抗肿瘤作用。

综上所述，白毛藤多糖通过调控miR-1270/CCNG2通路可抑制肺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。白毛藤多糖是一种有效的肺癌治疗药物，本研究的发现为白毛藤多糖在肺癌临床治疗中的开发应用提供了理论依据。