Rac1 在慢性应激抑郁大鼠中的作用及机制

包玲 张新风 丁佩

(1武汉市精神卫生中心精神科，湖北 武汉 430022；2荆州市精神卫生中心精神科)

抑郁症是世界常见的精神疾病之一，其特点是患者情绪障碍，具有自杀倾向〔1～3〕。抑郁症是一种严重疾病，其终生患病率为15%〔4〕。抑制症的发生严重影响了患者的生活质量，而目前对于抑制症有效的治疗手段十分有限，仅有三分之一的患者可以从当下的抗抑郁治疗中获利〔5,6〕。另一方面，近几十年来并没有真正的新型抗抑郁药进入市场〔6〕。因此需要进一步了解抑郁症的详细机制，以鉴定出新的有效的治疗目标。临床和基础研究表明，抑郁症的发生伴随着大脑结构的异常，如脑体积变小以及突触的功能和数目降低〔7〕。 Ras相关的C3 肉毒素底物(Rac)1是小G蛋白Rho GTPase家族的一员，是细胞骨架的关键调节因子，与突触可塑性密切相关〔8〕。同时，Rac1 在神经元发育过程中发挥重要作用，参与调节树突棘和兴奋性突触的形成〔9,10〕。此外当Rac1 功能紊乱时则会引起小鼠的认知功能障碍〔11〕。这些研究表明Rac1可能在抑郁中发挥重要作用，而目前国内对于Rac1在抑郁症中的研究却较少，对于其作用及机制尚不清楚。因此本研究通过构建大鼠慢性应激(CUMS)抑郁模型，探究Rac1在抑郁症吕的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，8周龄SD大鼠；聚合酶链反应(PCR)扩增仪购自德国Eppendorf公司；Step-one 实时荧光定量PCR 检测系统自美国Applied Biosystems 公司；Rac1过表达病毒购自吉凯基因；RT-PCR引物购自Invitrogen；抗突触素(SYP)、突触后致密蛋白(PSD)95、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAPDH抗体购自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1脑微注射过表达Rac1慢病毒 用1%的戊巴比妥麻醉大鼠并固定在脑立体定位仪上，剪开头皮，脑微注射Rac1过表达慢病毒。在注射病毒后1 w，进行CUMS造模。4 w后进行行为学检测。对照组大鼠脑微注射对照病毒(Rac1 con)。伏隔核坐标(前囟前1.5 mm，中线外侧±1.0 mm，深度5.9 mm)。 实验分为：对照+Rac1 con组，对照+Rac1组，模型+Rac1 con组，模型+Rac1组。每组10只。

1.2.2慢性轻度不可预知应激大鼠抑郁模型(CUMS)建立 将大鼠随机给予强迫游泳，冰水浴，夹尾，昼夜颠倒，食物和水的剥夺，闪光刺激等，持续4 w。

1.2.3糖水偏好实验(SPT) 实验前，大鼠禁食禁水，用两瓶1%蔗糖溶液使大鼠适应环境。24 h后，用自来水替换其中一个瓶子。在测试时，单独饲养大鼠，并给予大鼠200 ml自来水和200 ml 1%蔗糖溶液各1瓶。12 h换1次位置，24 h收取糖水瓶和自来水瓶。百分比(蔗糖摄入量/蔗糖摄入量加水摄入量)表示为糖水偏好(SP)。

1.2.4矿场实验(OFT) OFT可用于评估动物的运动活动和情绪反应。矿场为120 cm×90 cm×35 cm不透明敞箱。矿场底部被分成25个方格，其中外围场地由外围16个方格组成，中间9个方格被认为是中心区。测试时保持安静，将每只大鼠单独放入矿场的角落并使其自由探索5 min。通过行为视频分析大鼠在中央区活动距离和中心区停留时间。

1.2.5强迫游泳实验(FST) FST评估动物的绝望程度。实验时，每只大鼠置于垂直有机玻璃圆筒(45 cm高×20 cm直径)中，水温(25±1)℃，深度30 cm。记录5 min内的不动时间以供分析。结束后将大鼠从水中取出，用毛巾擦干，然后放回干净的笼中。

1.2.6实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测RAC1表达 Rac1引物序列为正向：5′-GCAAACAGATGTGTTCTTAAT-3′，反向：5′-TCATCCCTAAGATCAAGTTT-3′。β-actin作为内参，其引物序列为正向：5′-GGCCCAGAATGCAGTTCGCCTT-3′，反向：5′-AATGGCACCCTGCTCACGCA-3′。大鼠麻醉后灌流取材，采用Trizol法提取总RNA。根据逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录为cDNA，RT-PCR检测大鼠伏隔核区Rac1 mRNA的表达。

1.2.7Western印迹 用RIPA裂解液在冰上裂解组织样本，采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。蛋白样品加入上样缓冲液稀释，沸水浴5 min。采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST洗涤PVDF膜3次，每次15 min。5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次15 min，室温孵育二抗(1∶2 000)2 h；用TBST洗3次，每次15 min。用化学发光显色法显影，拍照统计。

1.3统计分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1Rac1 在CUMS大鼠伏隔核中表达降低 模型组Rac1 mRNA表达水平(0.55±0.14)显著低于对照组(0.98±0.21，P<0.001)。

2.2过表达Rac1缓解CUMS大鼠的抑郁样行为 与对照+Rac1 con 组相比，模型+Rac1 con 组SP显著降低，FST不动时间显著增加，OFT在中央区活动距离和时间显著缩短(均P<0.001)。与模型+Rac1 con组相比，模型+Rac1组SP显著升高，FST不动时间显著缩短，OFT在中央区活动距离和时间显著延长(均P<0.001)。见表1。

2.3过表达Rac1 增加CUMS大鼠SYP及PSD95 蛋白的表达 与对照+Rac1 con 组相比，模型+Rac1 con 组SYP、PSD95 蛋白表达水平显著降低(P<0.001)，与模型+Rac1 con 相比，模型+Rac1组SYP，PSD95 蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。见表1、图1。

表1 各组行为学变化及SYP、PSD95、GFAP蛋白表达

图1 Western印迹检测SYP及PSD95蛋白表达

2.4过表达Rac1增加CUMS大鼠GFAP的表达 与对照+Rac1 con 组相比，模型+Rac1 con 组GFAP蛋白表达水平显著降低(P<0.001)，与模型+Rac1 con 相比，模型+Rac1组GFAP蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。见表1、图2。

图2 Western印迹检测GFAP表达

3 讨 论

抑郁症与调节情绪和认知的大脑区域的体积减小及这些区域神经元突触的减少有关〔12〕。阻止或逆转这些神经元功能障碍可以达到抗抑郁的目的。Rac1可以调节多种神经元功能诸如细胞骨架动力学，轴突生长和导向，细胞存活，树突分支，棘形态，兴奋性突触形成及突触可塑性等〔8,13〕。已经证实Rac1参与几种神经系统疾病的发生如精神分裂症〔14〕，阿尔茨海默病〔15〕等。在抑郁症中，Golden等〔16〕研究发现抑郁模型小鼠和抑郁症患者死后伏隔核中RAC1的表达降低。本研究结果表明Rac1在慢性应激大鼠抑郁样行为发生中具有重要作用。

SYP是一种钙结合糖蛋白，广泛分布在神经突触前膜的囊泡中。它被认为是突触前末端的特异性标记蛋白。它的表达可以准确反映突触的密度，分布区域和功能状态〔17〕。PSD95是位于突触后膜的特异性分子，通过与相应受体或信号分子相互作用，调节神经元及突触生成和可塑性，神经递质及其他神经营养因子的合成〔18〕。SYP和PSD95的表达水平可以用来反映突触形态及生物功能的改变〔19〕。本研究结果表明过表达Rac1的在慢性应激大鼠中的抗抑郁作用通过促进伏隔核神经元和突触生成发挥作用。

星形胶质细胞具有支持营养神经元的作用。研究发现星形胶质细胞障碍与抑郁症的发生密切相关。患有重度抑郁症(MDD)的患者和抑郁症动物模型中GFAP阳性星形胶质细胞的数量或密度减少〔20〕。Rac1 与星形胶质细胞骨架重排和形态调节有关。Rac1特异性shRNA转染星形胶质细胞可以抑制星状星形胶质细胞的生长和成熟〔21,22〕。因此，Rac1表达降低可能是抑郁症中星形胶质细胞功能障碍的原因之一。本研究结果表明过表达Rac1可以抑制慢性应激抑郁大鼠中星形胶质细胞的丢失。星形胶质细胞的恢复可以促进神经保护作用，从而缓解大鼠抑郁样行为。