老年失眠患者血清miR-147表达与Treg/Th17水平的关系

秦冰 李莉 刘芳翡 胡亚琼

(1河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191；2河南医学高等专科学校附属医院神经内科)

老年失眠是临床常见的老年睡眠障碍，炎症反应是其主要危险因素之一，而引起失眠的主要因素有生理因素、疾病因素、精神因素、心理社会因素、环境因素、药物因素等。老年失眠是导致抑郁的重要因素，最终可能会导致大脑认知功能损伤，对老年人身心健康造成威胁，使其生活质量下降，不良结局发生率升高〔1,2〕。因此早期诊断和治疗对于降低老年失眠发生率十分重要。多种微小RNA(miRNA)参与中枢神经系统炎症反应。研究表明，miR-155能影响脑脊髓炎小鼠辅助性T细胞亚群(Th)1和Th17细胞分化，从而改变炎症因子表达水平，影响脑脊髓炎病程〔3〕。miR-147作为miR家族中重要一员，更能参与炎症反应〔4〕。Th在机体免疫反应和炎症反应中都能发挥重要调节作用〔5〕。其中调节性T细胞亚群(Treg)与Th17有相互拮抗的生理功能，因此炎症反应发生在机体内时，Treg/Th17比例会发生变化〔6〕。miR-147、Treg/Th17与老年失眠炎症反应都有一定联系，但目前关于两者在老年失眠患者血清中表达水平相关性的研究较少。因此，本研究通过检测失眠老人血清中miR-147、Treg/Th17水平，探讨miR-147与Treg/Th17水平失衡的关系，为老年失眠的预防和评估提供重要依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2019年7月因失眠于河南医学高等专科学校附属医院接受治疗的86例老年失眠患者(失眠组)，纳入标准：①符合中国睡眠研究会提出的《中国失眠症诊断和治疗指南》中的诊断标准〔7〕；②年龄≥60岁；③近1个月内未服用中药治疗者；④临床资料齐全者。排除标准：①其他疾病所致的继发性失眠者；②伴有肝、肾、肺等脏器功能不全者；③有风湿类疾病、其他心肺疾病及精神异常者；④有药物滥用史患者。本试验经河南医学高等专科学校附属医院伦理委员会批准，符合伦理学标准，受试对象均由专业人员详细告知家属研究内容并自愿参加，并签署知情同意书。其中男41例，女45例；年龄60～83岁，平均(71.13±6.17)岁，体重指数(24.15±1.24)kg/m2；同期选取84例健康体检老人作为对照(对照组)，其中男37例，女47例；年龄60～82岁，平均(70.96±7.35)岁，体重指数(24.26±1.35)kg/m2。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

收集患者入院时一般资料，如性别、年龄、体重指数(BMI)及匹兹堡睡眠质量指数量表(PSQI)评分〔8〕，其中该表有19个自评及5个他评项目，最低分0分，最高分21分，分数高代表睡眠质量差。

1.2主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(批号：DP419)购自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR® Green Mix试剂(批号：Q111-02)购自南京vazyme生物公司；miScript SYBR® Green qPCR试剂盒(批号：330504)购自德国QIAGEN公司；固定破膜剂(Fix&Perm)(批号：GAS-003)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人干扰素(IFN)-γ单克隆抗体(批号：BSA-0851)、藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人白细胞介素(IL)-4单克隆抗体(批号：LS-C7854)均购自美国Beckman公司。Bio-Rad iQ5型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪购自美国Bio-Rad公司；FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3样品采集及保存 抽取两组老人清晨空腹静脉血，3 000 r/min离心15 min后收集血清，离心半径8 cm，置于-80℃保存，待测。

1.4qRT-PCR法检测血清中miR-147水平 采用qRT-PCR检测两组血清中miR-147水平。RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪对miR-147进行扩增。qRT-PCR体系共10 μl：miScript SYBR® Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反应条件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、20 s，40个循环；72℃，10 min。miR-147及内参U6的引物序列：miR-147正向引物:5′-AAACATGGAGCAGCCACACATC-3′，反向引物：5′-TCGAGATGTGTGGCTGCTCCATGTTT-3′；U6：正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法对血清miR-147表达水平进行定量分析。

1.5流式细胞术检测血清中Treg/Th17水平 RPMI1640〔不含小牛血清(FBS)〕培养基等体积稀释100 μl血清，加入刺激剂10 μl，37℃、5% CO2培养箱培养4～6 h。混匀，加入CD8-PC7和CD3-PC5各10 μl，室温下避光孵育15 min；加入100 μl Fix&Perm中的固定液，室温避光孵育15 min；加入3 ml PBS，1 200 r/min离心5 min，离心半径10 cm，弃上清。每管中加入 100 μl Fix&Perm中的破膜和溶血液，各管加入IFN-γ-FITC和IL-4-PE 10 μl，室温下避光孵育15 min。每管中加入3 ml PBS，1 200 r/min离心5 min，离心半径10 cm，弃除上清；0.5 ml PBS重悬细胞，上机检测。每个样本每次检测1×104个细胞。

1.6血清炎性因子水平检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组血清中IL-6、C-反应蛋白(CRP)、转化生长因子(TGF)-β1、IL-17水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7统计学分析 采用SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson分析、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1两组PSQI评分比较 两组失眠组PSQI评分显著高于对照组〔(15.46±3.24)分vs(5.27±1.14)分；t=27.224,P<0.05〕。

2.2两组血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比较 失眠组血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平均显著高于对照组(P<0.001)。见表1。

表1 两组血清中miR-147、Th17、Treg及Treg/Th17水平比较

2.3两组血清炎性因子水平比较 失眠组IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均显著高于对照组(P<0.001)。见表2。

表2 两组血清炎性因子水平比较

2.4失眠老人血清中miR-147与Treg/Th17的相关性 失眠老人血清中miR-147与Treg/Th17水平呈正相关(r=0.536，P<0.05)。见图1。

图1 失眠老人血清中miR-147与Treg/Th17水平的相关性

2.5失眠老人血清miR-147、Treg/Th17与血清炎性因子水平相关性 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17与IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平均呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 失眠老人血清miR-147、Treg/Th17与血清炎性因子水平相关性

2.6影响老人失眠的多因素分析 将老人是否发生失眠作为因变量，以miR-147、Treg/Th17、IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17、PSQI评分为自变量进行Logistic回归分析，结果显示miR-147、Treg/Th17、IL-6是影响老人失眠的危险因素。见表4。

表4 影响老人失眠的多因素分析

3 讨 论

失眠指尽管有充足时间入睡，但仍存在持续难以入睡或睡眠质量下降并使日间功能受损的各类行为，其中炎症反应在其病情发展中有重要作用〔9〕。老年人失眠症发病率远高于年轻人，且老年患者长期失眠会出现思维能力下降、妄想、抑郁、紧张等严重精神障碍，并导致中枢神经受损〔10～12〕。因此，寻找预测老年失眠倾向标志物，是今后待解决的问题。

许多miR是酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)抗炎途径中重要调控因子，而miR-147与此途径中重要转录因子NF-κB有密切联系〔13〕。miR-147可通过调控某些炎性细胞因子水平，激发炎症反应，同时导致抗炎反应和促炎反应处于动态失衡，进而影响老年人睡眠状态〔14〕。林秋伟等〔15〕检测分析心肌梗死患者血清中miR-147，miR-214等含量，探讨其对病变程度及预后情况的判断价值，最终得出结论：miRNA可能通过调节炎性因子的表达来参与疾病发生和病情发展。本研究提示老年失眠患者血清中miR-147水平高于健康老人，miR-147可能通过在失眠老人血清中高表达来影响某些炎性因子的表达，进一步参与失眠的发生发展。

Th17和Treg是T细胞亚型中重要细胞，参与机体免疫反应，而免疫反应通常与炎症反应密切联系〔16，17〕。有研究表明，Treg/Th17细胞平衡比例变化与神经炎症反应有关，进一步可能会引发失眠病症。姜立刚等〔18〕通过对帕金森病患者外周血Treg/Th17水平进行检测分析，探讨Treg/Th17平衡与相关细胞因子含量变化的意义，结果证明患者外周血中Treg/Th17水平失衡，且这种失衡与帕金森病神经炎症反应可能有关。本研究结果提示失眠老人血清中Th17、Treg水平均升高，血清中Treg/Th17处于严重失衡状态，从而引发炎症反应，进一步加重老人失眠病症，老年失眠患者体内炎症水平相较于健康老人升高，miR-147、Treg/Th17相互作用影响老年失眠患者血清炎性因子IL-6、CRP、TGF-β1、IL-17水平，从而影响失眠，miR-147、Treg/Th17、IL-6水平变化影响失眠的发生，且随三者水平升高，失眠发生概率也升高。

综上所述，老年失眠患者血清中miR-147与Treg/Th17水平呈正相关，miR-147在血清中的表达水平对Treg/Th17状态失衡有关。临床上应密切关注miR-147、Treg/Th17在老年失眠患者血清中的水平，以便及时做出正确的诊断方法并可及时治疗。但哪些人群对失眠有易感性，miR-147因子水平是否和失眠易感性人群有关，都有待进一步研究。