不同果色五味子藤茎化学成分的质量评价

金银萍，郝岩，曲正义，郭靖，张浩※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春130112；2.吉林农业大学，吉林 长春130118）

五味子为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果实，习称为北五味子。五味子始载于《神农本草经》，列为上品，具有收敛固涩、益气生津及补肾宁心的功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴和心悸失眠等症[1]。临床应用于治疗病毒性肝炎、慢性传染性肝炎和肝硬化等肝系疾病；急慢性支气管炎、支气管哮喘等肺系疾病；心血管及糖尿病的治疗[2]。但是，五味子研究热点均集中在药用部位果实，随着研究的不断深入，五味子藤茎被认为是一种具有很大潜在药用价值和可持续利用的药用资源，具有多种药理活性，包括保肝、抗氧化、神经保护和抗炎等[3-7]。五味子藤茎独具的特有气味及丰富的营养成分也被用作调味剂和食品添加剂等。

五味子是一种多年生落叶藤本植物，果实为近球形或倒卵圆形的红色浆果。由于野生驯化的影响，五味子的果实在果色、果粒形状、果穗紧密度以及果粒表面的腺点密度等方面都存在广泛变异，尤其是果色的变异尤为明显，除存在粉红色、红色、紫红色和紫黑色等类型外，还存在黄色及白色等类型[8-10]。近年有报道[11]五味子果实颜色的多样性对其木脂素含量的影响，但是关于果实颜色多样性对五味子藤茎化学成分的影响至今未见报道。本文探讨了不同果实颜色的五味子藤茎中常见的有效成分的含量，并评价了不同果实颜色的藤茎样品之间的定量和定性变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用2018年3月17日采自通化国家农业科技产业园五味子优良种苗示范推广基地的藤茎样本，白、黄、红共3种果色的藤茎，每种采集3份，每份3个重复共计27份样品。经艾军研究员鉴定为五味子科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的藤茎。D-无水葡萄糖对照品（纯度≥99.5 %）购于北京化学试剂有限公司；齐墩果酸对照品（纯度≥98.0 %）购于四川维克奇生物科技有限公司；没食子酸（纯度≥98.0 %）购于Acros公司；芦丁和五味子醇乙（纯度≥98.0 %）购于上海源叶生物有限公司；五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素对照品（纯度≥98.0 %）购于中国食品药品检定研究所；色谱纯乙腈、甲醇购于美国Fisher公司；纯净水购于杭州娃哈哈集团，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Model Code UPB PDA检测器；电子天平BSA 124S-CW（德国Sartorius公司）；KQ-500DE型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；ST-360酶标仪（美国Biotek Epoch公司）；N-1100旋转蒸发仪（日本东京理化有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 总三萜的含量测定

1.3.1.1 供试品溶液的制备精密称取五味子藤茎样品2.0 g，粉碎过40目筛，将样品放置于100 mL具塞三角瓶中，加入无水甲醇50mL，常温超声提取（500W，40 kHz）30 min，提取3次，过滤，滤液经减压浓缩至干，用无水甲醇将其定容至25 mL棕色容量瓶内，摇匀即得供试品溶液。

1.3.1.2 对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品5.0 mg，甲醇超声溶解定容至25 mL的容量瓶中，摇匀即得浓度为0.20 mg/mL的对照品溶液。

1.3.1.3 标准曲线绘制及样品的含量测定精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至5 mL的容量瓶内，氮吹仪吹干，然后精密加入5%香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸0.8mL，振荡器上摇匀，60℃水浴15 min后，于冰水浴中放置5 min，取出，用冰醋酸定容至5.0 mL，摇匀即得系列齐墩果酸对照品溶液。按照相关文献中的方法，于547 nm测定吸光值，以齐墩果酸的浓度（x）为横坐标，吸光值（y）为纵坐标，绘制相应对照品的标准曲线[12]，见表1。

精密吸取供试品溶液0.5 mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“至5 mL的容量瓶内”起依法操作，测定吸光度，并利用标准曲线计算样品中总三萜的含量。

1.3.2 木脂素的含量测定

1.3.2.1 对照品溶液的配制精密称取各对照品适量，配成五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的混合对照品溶液，其质量浓度分别为114.8g/mL、65.7g/mL、46.9g/mL和63.9g/mL。

1.3.2.2 供试品溶液的配制精密称取五味子藤茎样品2.0 g，粉碎过40目筛，将样品放置在100 mL具塞三角瓶内，精密加入无水甲醇50 mL，超声（500 W，40 kHz）提取，每次30 min共提取3次，过滤，滤液经减压浓缩至干，经适量蒸馏水溶解后，用石油醚进行脱色处理，萃取液弃去，水层减压浓缩，用无水甲醇定容至25 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得。

1.3.2.3 色谱条件及样品的含量测定 采用ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱（2.1mm 50mm，1.7m）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱程序为：0~1 min，48~50%A；1~3 min，50~70% A；3~4.5 min，70~95% A；4.5~6.5 min，95%A；6.5~7.0 min，95~48%A；7~9 min，48%A；柱温35℃，样品温度15℃，检测波长254 nm，流速0.35 mL/min，进样量1.0L。结果表明，各对照品在相应的质量浓度范围内线性关系良好，见表1。利用标准曲线计算样品中各木脂素的含量，样品中总木脂素含量以五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的含量之和计算[13]。

1.3.3 总黄酮和总黄酮醇的含量测定

1.3.3.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品7.6 mg，于50mL容量瓶中用无水甲醇溶解定容，配制成0.152 mg/mL的对照品储备液。经适量无水甲醇稀释成系列浓度梯度的芦丁对照品溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备 同1.3.1.1。

1.3.3.3 标准曲线的绘制及样品的含量测定 精密吸取120L的2% AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列浓度芦丁对照品溶液，混匀，室温放置1.0 h，以不加芦丁对照品的试剂作空白对照，于420nm处测定其吸光度值[14]。绘制芦丁对照品的标准曲线，见表1。精密吸取120L的2%AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列浓度芦丁对照品溶液，再加入160L的醋酸钠溶液，混匀，室温放置2.5 h，以不加芦丁对照品的试剂作空白对照，于440 nm处测定其吸光度值[14]。绘制芦丁对照品的标准曲线，见表1。

1.3.4 总酚的含量测定

1.3.4.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸5.0mg，于5 mL容量瓶中经蒸馏水溶解定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的没食子酸对照品储备液，经适量蒸馏水稀释成系列浓度梯度的没食子酸对照品溶液。

1.3.4.2 供试品溶液的制备 同1.3.1.1。

1.3.4.3 标准曲线的绘制及样品的制备精密吸取系列浓度梯度的没食子酸对照品溶液0.1 mL，依次加入0.5 mL的Folin&Ciocalteu's phenol reagent和1.5 mL 20%的碳酸钠，混匀，用蒸馏水定容至10 mL的棕色容量瓶内，室温放置2.0 h，以不加没食子酸对照品的试剂作空白对照，于765 nm处测定吸光度[14]。绘制没食子酸对照品的标准曲线，见表1。

表1 五味子藤茎各种成分标准曲线、相关系数和线性范围Table 1 The standard curves,correlation coefficients and linear ranges of the compositions from the stems of S.chinensis

1.3.5 多糖的含量测定

1.3.5.1 供试品溶液的制备精密称取五味子藤茎样品2.0 g，粉碎过40目筛，放置于250 mL软底烧瓶中，加入50倍量的80%乙醇，冷凝回流提取2次，每次1.0 h，过滤弃去滤液，将药材挥干后加入50倍量的蒸馏水，回流提取2次，每次2.0 h，过滤，合并滤液，滤液经减压浓缩至一定体积，加入乙醇进行醇沉处理（醇沉浓度80%），4℃静置过夜，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀，无水乙醇洗涤两次，干燥即得供试品多糖。供试品多糖经蒸馏水溶解定容至100mL，即得供试品溶液。

1.3.5.2 标准曲线的制备及样品的含量测定精密称取D-无水葡萄糖对照品10.0 mg于100 mL容量瓶中加水溶解定容，得0.10 mg/mL的对照品溶液。精密量取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL的葡萄糖对照品溶液于10 mL具塞刻度试管中，用蒸馏水将其体积补至1.0 mL，加入6%苯酚溶液0.5 mL，摇匀，迅速加入2.5 mL浓硫酸，立即摇匀。室温放置30 min，490 nm处测定样品的吸光值[12]，绘制D-无水葡萄糖对照品的标准曲线。

1.3.6 总挥发油的含量测定精密称取不同果色的样品25 g置于1 000 mL的软底烧瓶中，加入250 mL蒸馏水，经挥发油提取器提取至不再有挥发油流出即可。将挥发油收集在密封离心管中，加入适量的无水硫酸钠去除多余水分，然后置于棕色玻璃瓶中，于4℃冰箱中储存备用。样品挥发油的产量按每100 g干物质中所得的体积数来表示。

1.4 数据处理

使用软件SIMCA-P 14.0进行主成分分析和聚类分析，使用Excel 2013进行其他数据的统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 成分分析

木脂素和多糖类等成分是五味子的主要活性成分，是其发挥疗效的重要物质基础，也是五味子质量评价和品种选育需要考察的重要因素[16-19]。表2是27份五味子藤茎化学成分的测试分析结果，由表2可知，五味子藤茎化学成分中木脂素、多糖和挥发油的变异系数较大，说明这些成分存在明显差异，遗传多样性比较丰富，可做为五味子藤茎质量评价的主要理化指标。其中变异系数最大的是木脂素类成分，其也是历代药典评价五味子质量的主要技术指标，因此木脂素成分是五味子品种选育需要考察的重要因素之一。

表2 五味子藤茎主要化学成分的变异系数分析Table 2 The variation coefficient analysis of the main chemical compositions from the dried stems of

2.2 不同果色五味子藤茎化学成分的含量分析

从表3和图1可以看出，不同果色五味子藤茎的化学成分含量间存在明显差异。其中白果五味子藤茎样品中木脂素、三萜和黄酮醇的含量最高，分别高达0.611%、6.435%和0.600%。红果五味子藤茎样品中多糖和黄酮的成分含量较高，分别为8.370和0.567%。黄果五味子藤茎中酚类和挥发油的成分含量较高，分别为3.361%和1.920%。通过对不同果色藤茎样本的测试分析，结果表明五味子藤茎种质资源间化学成分含量的差异非常明显。

图1 不同果色五味子藤茎化学成分的含量Fig.1 The contents of chemical composition from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

表3 不同果色五味子藤茎化学成分的含量Table 3 The contents of chemical compositions from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

2.3 聚类分析

本研究采用HCA，根据化学成分的相似性来区分五味子藤茎种质资源间的差异。聚类分析结果如图2所示，27份来自不同果色五味子藤茎的样品被分成了3个类群。白果的五味子藤茎能够与另外两种果色藤茎明显地分开，两者的落点距离在27左右，红果和黄果藤茎样品两者间的落点距离也很远在14左右。因此，HCA能成功地用于不同果色五味子藤茎的种质资源鉴定。

图2 聚类分析图Fig.2 The dendrogram of the cluster analysis

2.4 主成分分析

从得分散点图及成分载荷图3中可以看出，不同果色五味子藤茎的样本能够得到较好的分离，说明不同果色五味子藤茎间的化学成分存在明显差异。通过PC1能够优先将白果藤茎与红果藤茎及黄果藤茎分离开；而红果藤茎和黄果藤茎之间能够被PC2分离开，这个主成分分析结果与HCA的结果是一致的。

图3 不同果色五味子藤茎化学成分的得分散点图（左）及成分载荷图（右）Fig.3 The scatter plots(left)and loading plots(right)from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

在PC1载荷图中，三萜和木脂素类成分具有较高的正值，且成分贡献率在90%左右，表明白果五味子藤茎中含有较高含量的三萜与木脂素类成分。在PC2载荷图中，黄酮醇和多糖的成分贡献均大于90%且具有较高的正值，表明红果五味子藤茎中含有较高的多糖类成分，而白果五味子藤茎中含有高含量的黄酮醇类成分。

表4 化学成分的贡献率Table 4 The contribution of chemical compositions

3 讨论

从本文的研究中可以清晰的发现，不同果色五味子藤茎的化学成分含量差异显著。在前人的文献报道[20-24]中指出，五味子的化学成分含量受种类、品种、地理来源、气候条件、采收加工及贮藏等因素的影响很大，而在我们的研究中，所有样品都来自同一种植园，具有相同的地理来源和气候条件，采收加工及贮藏等条件也一致。具有不同果色的五味子藤茎样品之间化学成分的差异很可能更多地受基因型的影响而非环境因素的影响。这些化学成分的差异可为五味子藤茎种质资源的鉴定以及质量评价提供理论参考。同时，亦可为五味子藤茎的资源利用与开发提供重要的理论基础。