基于线粒体ND1基因和核糖体ITS2基因对猪疥螨的分子鉴定

黄福强，唐志强，李静，孙悦翔，钟秉洲，戚少贤

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山528225）

疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨属的疥螨（Sarcoptes scabie）寄生于人和其他哺乳动物表皮内，引起称为疥疮（又称疥癣、癫病）的一种顽固性、接触性和传染性皮肤病[1]。疥螨的宿主种类较多，且地理分布广泛，受环境因素的影响使疥螨的形态和生物学特性发生了一定的遗传变异，因此采用传统的分类学方法难以将不同宿主和不同地理来源的疥瞒进行分类[1,2]。一直以来，学者们对疥螨属的螨虫分类持有两种截然不同的观点，即不同宿主和地理来源的疥螨分离株应归类为不同的种；不同宿主和地理来源的疥螨分离株应为一个种的不同变种，如疥螨人变种（Sarcoptes scabiei var.hominis）、疥螨猪变种（S.scabiei var.suis）和疥螨犬变种（S.scabiei var.canis）等。各变种之间在形态上差别甚微，对宿主特异性并不十分严格，如经常接触家畜的人受到家畜疥螨的侵袭，也能转移到人体上，但在生物学和致病性上有差异[1,2]。猪感染疥螨多发生在5月龄以前，通常由头部开始，常发生在眼圈、颊部和耳朵等部位，痒感剧烈，有时患部因摩擦而出血。病程延长时，食欲不振，营养衰退，甚至死亡[2]，给养猪业造成了巨大的损失。

2020年10月作者收到广东某猪场寄送给实验室的患有猪皮肤病病例的皮屑时，通过镜检发现皮屑中存在疑似疥螨样昆虫尸体，为了进一步确诊该猪场是否感染了疥螨病及初步探究本次所采集样本与nt数据库中疥螨的同源性以及疥螨亚目各种属的进化关系，本研究以疥螨线粒体ND1基因序列和核糖体ITS2基因为靶标分子对所采集样品进行分子鉴定及进化分析。

1 材料与方法

1.1 疥螨

采自广东某猪场患皮肤病猪的皮屑。

1.2 仪器设备

双人双面净化工作台（青岛海尔股份有限公司），电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），LabCycler PCR仪UNO-II型（Biometra公司），小型高速冷冻离心机（Cenfrifuge 5424R），DYY-4C型电泳仪（北京六一仪器厂），JJ500型电子天平（常熟双杰测试仪器厂），XH-C旋涡混合器（金坛市华城开元实验仪器厂），WFH-201-B全封闭紫外透射仪（广州市深华生物技术有限公司）。

1.3 主要试剂

LB/Amp/X-gal/IPTG平板培养基，5 TBE buffer（pH 8.3），1%琼脂糖凝胶，PBS，生理盐水，Premix Tap，E.coli DH5感受态细胞，EcoR I酶，HindIII酶，DL2000Maker，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel，DNA Extraction Kit Ver.4.0，Omega Bio-tek Stool DNA Kit（D4015-01），TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit。

1.4 疥螨总DNA提取

将从广东某猪场采集的疥螨样品按Omega Biotek Stool DNA Kit试剂盒所推荐的方法对皮屑样品进行DNA提取，消化时间为5 h。

1.5 引物设计

疥螨ND1基因引物根据GenBank序列号为MF 083743的疥螨线粒体基因组ND1基因序列设计引物对ND1_F（5’-AGCGGAAGGTGAGTCAGAAATTG-3’）和ND1_R（5’-ACGAATACGAGGAAATCTACAACGA-3’），而ITS2基因引物对ITS2_F（5’-GGGCTGCAGTATC CGATGGCTTCGT-3’）和ITS2_R（5’-CGGGATCCTT CRCTCGCCGYTACT-3’）参考自文献[3]，此引物扩增出来的序列包含了5.8S rDNA基因部分序列、ITS2基因全部序列以及28S rDNA基因部分序列[3]，本实验中对该序列命名为“ITS2+”。两基因引物对由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.6 目的基因片段PCR扩增

1.8 PCR产物的克隆及测序

用TaKaRa pMDTM18-T载体克隆试剂盒推荐的方法进行扩增片段的克隆和转化；利用TaKaRa质粒纯化试剂盒所推荐的方法对重组质粒进行抽取，然后在0.2 mL的EP管中配制20L的酶切反应体系并在37℃水浴2 h后进行电泳检测。将酶切反应阳性的菌样送样，并委托生工生物工程（上海）有限公司对其测序。

1.9 生物信息分析

1.9.1 blastn相似性比较为了获取本次测序的ND1基因及ITS2+序列与nt数据库中疥螨目已有相关基因序列相似性高低，本研究在nt数据库中以“Sarcoptiformes and(nd1 or nad1)”为检索词搜索疥螨目的ND1基因，共获得66条序列；以“Sarcoptiformes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”为检索词，共获得663条ITS2基因相关序列。以下载的上述两组疥螨目ND1及ITS2基因序列分别作为测序所得ND1和ITS2+序列的目标数据库。通过本地blastn程序，按照命令“blastn-query query_name-db database_nameout result_name-evalue 1E-5-max_hsps 1-max_target_seqs 1000”进行局部比对，blastn比对结果用circoletto（http://tools.bat.infspire.org/circoletto） 进行优化（由于nt数据库对中ITS2基因序列过多，可视化时blastn结果比中Alignment length、Percentage of identical matches、Expect value、Bit Score及物种信息都相同的序列仅保留一条）。

1.9.2 进化分析为了应用本次测序的ND1基因及ITS2基因序列分析不同动物及地区分离的疥螨属基因突变情况及进化关系，应用MEGA-X软件对测序数据和nt数据库中下载到的19条疥螨属ND1基因[以Sarcoptes and(nd1 or nad1)进行检索]和301条ITS2基因[以“Sarcoptes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”进行检索]进行比对并构建系统发生树。由于ITS2基因序列较多，进化分析时相同宿主来源序列只保留一条最长的ITS2基因序列，共有56条nt数据库中的序列参与建树。构建进化树时先用MEGA-X软件嵌套的ClustalW程序对本次测序获得的ND1基因及ITS2基因和nt数据库中下载的相应基因序列进行（默认参数）比对，然后手动校正得到的矩阵，对同一基因的所有序列都修剪到相同的长度，然后采用最大似然法（ML）构建系统发育树，各分支的支持率利用自展法（Bootstrap,1 000次重复）进行检验，ND1基因以尘兔痒螨（Psoroptes cuniculi）为外群，ITS2基因以猫背肛螨（Notoedres centrifera）为外群。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

利用DNA提取试剂盒提取皮屑总DNA，然后再行PCR扩增、转染和酶切。经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增片段大小，其中ND1基因扩增序列在200 bp左右，ITS2基因扩增序列在400 bp左右，均与预期扩增片段大小相符，见图1。

2.2 blastn相似性比较

通过检索nt数据库发现，nt数据库中分别有66条ND1和663条ITS2基因相关序列（截止2021年3月14日），通过blastn比对（E-value<1E-5）发现疥螨目中共有56条线粒体ND1基因序列与本实验获得的ND1基因序列有比对结果（图2 A），且本实验获得的ND1基因部分序列与19个疥螨（Sarcoptes scabiei）线粒体基因组ND1基因相似性最高（红色彩带对应序列，Identity>99%，E-value<6.20E-106），其次是户尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，NC_012218.1，EU884425.1，Identity=80%，E-value=1.37E-44）、兔痒螨（Psoroptes cuniculi，NC_024675.1，KJ957822.1，Identity=74%，E-value=9.84E-34）和粉尘螨（Dermatophagoides farinae，NC_048990.1，GQ465336.1，Identity=74%，E-value=4.18E-32）（绿色彩带对应的序列）；本实验获得的ITS2+序列与疥螨属ITS2基因序列相似性最高，与其他疥螨目ITS2序列差异较大（图2 B），但blastn结果提示在现有的nt数据库序列中疥螨属与背肛螨属（Notoedres）ITS2基因序列最为相似（比对序列长度为85~89，比对序列部分相似性为95.50%~97.80%，E-value为7.16E-35~4.83E-37）。以上结果表明本次测序获得的序列为疥螨属基因组中的基因序列。

图2 疥螨猪变种ND1序列（A）和ITS2+（B）序列与疥螨目相应基因序列blastn比对结果红色彩带代表E-value值相对最小，橙色次之，绿色再次之，蓝色最大，彩带宽度表示比对序列长度。Fig.2 The blastn comparisons of the Sarcoptes scabiei var.suis against the ND1 and ITS2 sequences in the NT database.The red lines connect DNA sequences with the lowest quartile of e-value and blue lines with the highest quartile of E-value.The line width means the alignment length.

2.3 序列比对及分子进化树构建

本次扩增的ND1基因序列长度为211 bp，运用扩增的ND1基因序列长度及其全长序列分别构建进化树，结果显示本次扩增获得的长211 bp的ND1基因序列与澳大利亚地区犬、考拉和袋熊真皮内采集到的疥螨属基因序列聚类（图4 A）。ND1全长序列分析显示nt数据库中现有19条ND1基因全长序列可以聚为5个分支（分支中序列数大于等于2条，bootstrap值大于50%）（图4 B），而以本次扩出的211 bp长度仅仅有2个聚类。但不论是全长聚类还是部分序列聚类，聚类序列中均有不同来源的动物。ITS2基因聚类分析显示，疥螨属所有57条序列及背肛螨属的4条序列能各自聚为一大类，疥螨属序列和背肛螨属序列明显地分开，但在参与建树的57条（包含本实验获得的序列）疥螨属ITS2基因序列中，仅有6条序列可以先形成2个小的聚类，其他51条序列没有聚类，见图3。

图3 基于核糖体ITS2基因构建的疥螨环状进化树Fig.3 The circle ML phylogenetic trees of rDNA ITS2 of Sarcoptes mites

3 讨论

形态学鉴定发现来自不同地区或动物的雌性疥螨分离株在形态学上有所差异，但有些研究也发现即使是来自同一分离株的不同个体疥螨也存在差异[3]。因此在形态学上很难说清楚雌性疥螨形态的差异是由不同分离株引起还是由不同的个体引起。随着分子标记技术的发展，研究员期望通过DNA分子标记技术来阐明疥螨各地区或不同宿主的遗传变异关系。

由于核糖体RNA基因和线粒体基因受到的选择压力较小，进化率快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多样性，因此常用核糖体DNA的ITS区域和线粒体基因作为虫种鉴定分子标记[4]。近年来对疥螨的分子鉴定往往应用ITS2基因序列作为分子标记，有些研究也应用疥螨CO1等线粒体基因进行进化分析[5,6]，但还未见ND1基因用于疥螨各变种基因变异分析的文章。随着高通量测序技术的发展，已有不同动物来源的疥螨线粒体全基因组被解析[6,7]。疥螨ND1基因全序列也已通过第二代测序方法拼接完成[6,7]，鉴于此，本研究应用了疥螨分析常用的核糖体ITS2基因及目前为止还未用于疥螨分类和进化分析的线粒体ND1基因序列。

本试验中ITS2基因序列分析结果显示，所获得序列与nt数据库中疥螨属各变种ITS2基因相似度最高，与疥螨亚目中背肛螨属进化关系相对较近，且所有疥螨的ITS2序列能聚类在一起，有较高的自展值（99），然后再与外群聚类。同时疥螨属内部聚类时ITS2仅有少部分序列能有分支聚类。Zahler等[3]1999年在对疥螨ITS2序列分析时发现来自四大洲9种不同宿主的23株疥螨分离株的变异程度较小，建议将各地分离株归为一个独立的种，S.Alasaad[8]和Li等[9]也于2009年和2018年通过扩增世界各地收集到的疥螨ITS2基因序列及GenBank中登录的疥螨ITS2基因进行分析，指出ITS2在疥螨各变种间变异非常小，无法对采至不同地区或不同动物的疥螨ITS2序列进行有效聚类。本试验也发现虽然ITS2作为分子标记能有效地区分疥螨亚目中不同属的螨虫，如痒螨、背肛螨等，但由于在疥螨属内ITS2基因序列差异很小，无法区分疥螨属内其他的种或变种。通过对ITS2基因序列的分析，本试验也支持疥螨属各分离株为单独种的结论。

本试验中ND1基因序列分析结果显示，所获得序列也与nt数据库中疥螨属各变种ND1基因相似度最高，其次为户尘螨、兔痒螨和粉尘螨，且疥螨属内各变种进化分析显示，有部分疥螨ND1基因序列可以分支聚类，但聚类的序列与采集的地区和宿主种类无关，且ND1基因全长序列的分支聚类要比部分序列多，说明不同分离株ND1基因序列变异位点信息比ITS2基因变异位点信息丰富，且ND1基因全长序列变异位点要较本次扩增序列多。在以后的实验中，应用ND1基因全长序列对不同地区或不同宿主来源的疥螨进行分析，将会获得更多有效变异位点信息。

最后，通过本次试验得出在广东某猪场猪皮肤结痂中发现的昆虫样生物为疥螨，且本实验再次验证常用的ITS2基因序列不宜作为疥螨属内各变种变异进化分析的分子标记，但本实验所筛选出的ND1基因在疥螨各变种中有较丰富的变异位点信息，可以作为疥螨属内各变种进化分析的有效候选分子。