sEH抑制剂激活EPCs促进梗死心肌Ⅷ因子生成的研究*

王振河，姜德谦，许丹焰△

(1.厦门大学附属第一医院心内科，福建厦门 361003；2.中南大学湘雅二医院心内科，长沙 410011)

环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)可促进缺血组织生成新生血管[1]，可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)可导致细胞内EETs被迅速降解[2]。因此，使用sEH抑制剂可抑制EETs迅速降解，有效增加EETs在细胞内浓度和效用[3-4]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表达过氧化物酶增殖体激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ,PPAR-γ)[5]，且EETs是PPAR-γ内源性激动剂[6]。所以，sEH抑制剂t-AUCB可降低EPCs的EETs降解，增强EPCs的PPAR-γ表达水平及活性，促进EPCs对梗死心肌血管生成作用的影响。本研究通过检测t-AUCB干预的EPCs移植后不同时间点梗死心肌边缘区Ⅷ因子的表达情况，验证t-AUCB对EPCs促进梗死心肌血管生成功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

80只清洁级实验雄性小鼠，6周龄，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。EPCs表面分化抗原购自英国Beckmancoulte公司；免疫组织化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司，分析纯试剂；Ⅷ因子购自英国Beckmancoulte公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组

直接注射不同浓度(0、1、10、50、100 μmol/L)t-AUCB的小鼠作为t-AUCB组。PPAR-γ阻断剂GW9662(5 μmol/L)预干预30 min后，再加入100 μmol/L t-AUCB干预的小鼠作为GW9662+t-AUCB组。

1.2.2EPCs的分离、培养

75%乙醇溶液处死小鼠，消毒，无菌条件下去除小鼠胫骨及股骨肌肉及皮毛，1 mL注射器抽取无菌生理盐水，冲出小鼠四肢长骨骨髓，密度梯度离心5 min，吸取中间单个核细胞，按5×105/mL密度转移至包被有大鼠Fibronectin 的细胞培养皿中，加入含5%胎牛血清和生长因子的EBM-2培养基，4 d后全量换液，隔天半量换液，倒置相差显微镜下观察不同时间点细胞形态。

1.2.3EPCs的鉴定

细胞培养7 d后，加入Dil-ac-LDL(10 mg/L)染色，观察细胞摄取Dil-ac-LDL结果；流式细胞仪检测EPCs表面分化抗原CD34、CD133、CD31、Flk-1表达情况。

1.2.4心肌梗死模型制作

小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定，气管插管，小鼠呼吸机辅助呼吸，行术前心电图检查；75%乙醇溶液消毒，沿着胸骨左缘5～6肋间隙剪开皮毛及肌肉、心包，暴露心脏，沿左心耳与肺动脉圆锥交界处下方2～3 mm处进针，深度为1～2 mm，7-0尼龙线结扎左前降支，缝合，观察小鼠心肌搏动及颜色是否发生变化，复查心电图，肌内注射青霉素2万单位，日光灯照下饲养。

1.2.5免疫组织化学

心肌梗死模型制作后1 h，尾静脉注射200 μL外周培养7 d的1×106/mL EPCs细胞悬液，于注射后1、3、7、14、28 d处死小鼠，开胸，取出心脏，洗净心腔血液，甲醛固定，切片，行免疫组织化学检测心肌梗死后各组梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 小鼠EPCs的生长情况

离心分离至培养瓶时，培养瓶内的细胞呈悬浮状，种类繁多，少量可聚集；培养24～48 h，悬浮的细胞开始贴壁；培养4 d后倒去培养瓶内液体，倒置显微镜下观察，可见贴壁生长的细胞开始形成菊花状集落，集落形态表现为外周梭形细胞包围中央圆形细胞；培养7 d后中央圆形细胞逐渐向梭形细胞转化；培养8 d后开始出现索状细胞；培养10 d EPCs在培养板上逐渐融合，并向类圆形和多角形铺路石样细胞转化，见图1。

A:培养4 d；B:培养7 d；C:培养8 d；D:培养10 d。

2.2 小鼠EPCs摄取Dil-ac-LDL能力

培养的EPCs加入Dil-ac-LDL干预后，将细胞置于荧光显微镜下，EPCs摄取Dil-ac-LDL后显示红色荧光，结果显示Dil-ac-LDL细胞摄取率达95%以上，见图2。

2.3 小鼠EPCs表面分化抗原流式细胞仪鉴定结果

流式细胞仪检测小鼠EPCs细胞表面分化抗原表达情况，CD34为(53.89±0.34)%，CD133为(52.79±0.67)%，CD31为(36.67±0.93)%，Flk-1为(43.88±0.49)%。

A：培养8 d未行Dil-ac-LDL干预细胞；B：干预后摄取Dil-acLDL阳性细胞，显示红色荧光。

2.4 制作小鼠心肌梗死模型及心肌梗死前后心电图变化

消毒麻醉及暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支制作心肌梗死模型，结扎瞬间可见结扎部位以下心肌变白，活动幅度明显减弱。结扎冠状动脉左前降支前，前壁导联的ST段位于等电位线，结扎左前降支后复查心电图可见前壁导联的ST段抬高，损伤电流产生，表明心肌梗死模型制作成功，见图3。

2.5 不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后不同时间梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

2.5.1不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后1 d梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

0 μmol/L t-AUCB组可检测到少量Ⅷ因子表达，随着浓度增加，梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平逐渐增加，GW9662+t-AUCB组较100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显减少。与0 μmol/L t-AUCB组比较，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB组与0、100 μmol/L t-AUCB组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、表1。

2.5.2不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后3 d梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

0 μmol/L t-AUCB组3 d Ⅷ因子表达较干预1 d有所增加，但总体表达水平仍较少，随着浓度增加，梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平逐渐增加，GW9662+t-AUCB组较100 μmol/L t-AUCB组，Ⅷ因子表达水平明显减少。与0 μmol/L t-AUCB组比较，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB组与0、100 μmol/L t-AUCB组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5、表1。

A：开胸，撑开心包，暴露左心耳；B：左心耳下1～2 mm处结扎冠状动脉左前降支;C：结扎前心电图；D：结扎血管后心电图。

表1 不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后不同时间点梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

A：0 μmol/L t-AUCB组；B：1 μmol/L t-AUCB组；C：10 μmol/L t-AUCB组;D:50 μmol/L t-AUCB组;E:100 μmol/L t-AUCB组；F:GW9662+t-AUCB组。

2.5.3不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后7 d梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

0 μmol/L t-AUCB组7 d Ⅷ因子表达较前增多，但量仍较少，随着浓度增加，梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平开始大幅度增加，10、50 μmol/L t-AUCB组间跨越幅度最大；GW9662+t-AUCB组较100 μmol/L t-AUCB组，Ⅷ因子表达水平明显减少，为0～1 μmol/L。与0 μmol/L t-AUCB组比较，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB组与0、100 μmol/L t-AUCB组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6、表1。

A：0 μmol/L t-AUCB组；B：1 μmol/L t-AUCB组；C：10 μmol/L t-AUCB组;D:50 μmol/L t-AUCB组;E:100 μmol/L t-AUCB组；F:GW9662+t-AUCB组。

2.5.4不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后14 d梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

0 μmol/L t-AUCB组14 d Ⅷ因子表达缓慢增加，随着浓度增加，梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平大幅度增加，增加幅度较3、7 d更大，GW9662+t-AUCB组较100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显减少。与0 μmol/L t-AUCB组比较，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB组与0、100 μmol/L t-AUCB组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图7、表1。

2.5.5不同浓度t-AUCB干预的EPCs注射后28 d梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况

0 μmol/L t-AUCB组28 d Ⅷ因子表达仍缓慢增加，随着浓度增加，梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平增加，增加幅度较7、14 d有所放缓，GW9662+t-AUCB组较100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显减少。与0 μmol/L t-AUCB组比较，1、10、50、100 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达水平明显增多(P<0.05)；GW9662+t-AUCB组与0、100 μmol/L t-AUCB组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图8、表1。

A：0 μmol/L t-AUCB组；B：1 μmol/L t-AUCB组；C：10 μmol/L t-AUCB组;D:50 μmol/L t-AUCB组;E:100 μmol/L t-AUCB组；F:GW9662+t-AUCB组。

A：0 μmol/L t-AUCB组；B：1 μmol/L t-AUCB组；C：10 μmol/L t-AUCB组;D:50 μmol/L t-AUCB组;E:100 μmol/L t-AUCB组；F:GW9662+t-AUCB组。

3 讨 论

骨髓来源单个核细胞贴壁后，贴壁生长的细胞由圆形细胞逐渐向梭形细胞，再逐渐变为类圆形及多角形细胞改变，Dil-ac-LDL细胞摄取率达95%以上，与同型分化抗原比较，培养的EPCs细胞表面分化抗原流式细胞仪检测结果为符合EPCs表型，提示培养的细胞为高纯度EPCs。沿左心耳与肺动脉圆锥交界处下方2～3 mm处进针，深度为1～2 mm，7-0尼龙线结扎左前降支，制作心肌梗死模型，结扎后结扎位点以下心肌变白，活动幅度减弱，之前位于等电位线的ST段明显抬高，提示心肌梗死模型制作成功。

血管生成为心肌梗死后梗死心肌修复的重要指标，有多个研究发现体外移植的EPCs可通过多种机制促进梗死心肌修复，例如移植的EPCs持续分泌囊泡促进梗死心肌血管生成[7]，通过抑制心肌梗死后炎性反应及氧化应激促进梗死心肌修复[8-9]，而sEH可增强EPCs功能[5-6]，所以本研究检测sEH抑制剂干预的EPCs移植后不同时间点小鼠梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达情况，检测移植的EPCs对梗死心肌血管生成的影响，同时检测sEH抑制剂t-AUCB对EPCs增强梗死心肌血管生成功能的促进作用。

对0 μmol/L t-AUCB组Ⅷ因子表达情况分析发现，即使未干预sEH，随着时间延长，移植的EPCs仍可促进梗死心肌血管生成[10-12]，只是程度较小，相同时间内血管生成数较少，给予t-AUCB干预后，EPCs促进梗死心肌血管生成作用得到明显增强[13-18]，且t-AUCB干预浓度越大，EPCs对梗死心肌血管生成促进作用越强；而在注射EPCs后早期，即注射后1 d，就可观察到梗死心肌边缘血管生成，提示t-AUCB及EPCs在注射后早期即可发挥作用，或许在注射前的体外干预过程中，t-AUCB已明显增强EPCs活性。而GW9662+t-AUCB组梗死心肌边缘区Ⅷ因子表达水平明显下降，甚至低于1 μmol/L t-AUCB组。上述结果提示在注射EPCs后1 d，注射的EPCs即可促进梗死心肌血管生成；给予t-AUCB后，EPCs对梗死心肌血管生成作用得到极大加强，一旦阻断PPAR-γ通路，EPCs对梗死心肌血管生成作用则被大大抑制，但不能完全被抑制。

综上所述，t-AUCB可通过减少EETs降解激活EPCs上PPAR-γ从而促进EPCs发挥作用，且t-AUCB可呈浓度正相关发挥其对EPCs激活作用。当阻断PPAR-γ后，t-AUCB对EPCs的激活作用被明显抑制，提示PPAR-γ通路在t-AUCB激活EPCs过程中发挥重要作用。但阻断PPAR-γ通路后,t-AUCB对EPCs的激活作用尚未被完全阻断，提示除了PPAR-γ通路外，t-AUCB可通过其他通路激活EPCs，从而发挥其在心血管领域中的作用。