多子小瓜虫对三种化学药物的敏感性研究

李雪菡，齐红莉，吕湘琳，杨广

多子小瓜虫对三种化学药物的敏感性研究

李雪菡，齐红莉通信作者，吕湘琳，杨广

（天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300392）

对从锦鲤（）分离出的多子小瓜虫（）采用离体单克隆培养，选用硫酸铜和硫酸亚铁合剂（5∶2）、高锰酸钾溶液及福尔马林，3种化学药物探究其对多子小瓜虫的致死情况。结果表明：3种药物浓度均与多子小瓜虫的死亡率存在正相关趋势，且5.6 mg/L的硫酸铜和硫酸亚铁合剂、8 mg/L的高锰酸钾溶液、120 mg/L的福尔马林都能全部致死多子小瓜虫；多子小瓜虫对3种化学药物的敏感性为：硫酸铜、硫酸亚铁合剂＞高锰酸钾溶液＞福尔马林。研究结果在一定程度为小瓜虫病的治疗及预防提供相应的数据支持和试验基础。

多子小瓜虫；硫酸铜、硫酸亚铁合剂；高锰酸钾溶液；福尔马林；敏感性

多子小瓜虫（）隶属于原生动物门（Protozoa），寡膜纤毛纲（Oligohy- menophorea），膜口目（Hymenostomatida），凹口科（），小瓜虫属（）[1-3]，由FOUQUET在1876年正式命名[4]，是养殖鱼类最常见的寄生虫之一[5-8]，具有生长繁殖快、分布范围广、营寄生[6，9]等特点，对国内外的养殖鱼类造成极大的影响[10-11]。多子小瓜虫生活史主要为幼虫期、包囊期和成虫期[6，10-13]，因幼虫具感染性，当其从包囊中孵化后，会寻找宿主并钻入宿主表皮内[9，14-15]，一般多寄生在鱼口、头、鳃、眼及皮肤等部位[9]。鱼类感染后，患病鱼体表面会出现大量肉眼可见的小白点，因此小瓜虫病亦称“白点病”[15-16]。此病发病传染快，死亡率高[13]，给水产养殖业带来严重的经济损失[12-14]。在缺氧、水温不断升高、鱼类繁殖或拥挤的养殖环境中，不流动的小水体及集约化养殖中都极易爆发小瓜虫病[7，9，16]。我国小瓜虫病的流行季节一般为每年4-5月和11-12月[12-13]，水温18～23 ℃时易爆发小瓜虫 病[10-12]，此病是养殖渔业一大难题，国内外许多学者都围绕其病原性、形态、生活史、免疫及防治等方面开展了大量的科学研究[15]，目前主要防治手段为物理防治如改变水体温度[11-12]、pH和盐度[17]等方法；或是化学防治如使用化学药物如福尔马林[18]、姜黄素（Curcumin）[19]、单宁酸（Tannic Acid）[20]；或是使用其他简易药物进行治疗如生姜辣椒合剂、五倍子、生石灰等[5-6]；或是疫苗防治如制备小瓜虫病疫苗等[6]。

本试验采用对多子小瓜虫幼虫的离体单克隆培养，选用三种常用于观赏鱼的药物即硫酸铜和硫酸亚铁合剂（5∶2）、高锰酸钾溶液以及福尔马林作用于离体多子小瓜虫，从而研究其药物敏感性，为小瓜虫病的治疗及预防提供相应的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验材料为天津农学院观赏鱼实验室患多子小瓜虫病的锦鲤。小牛血清（MP20005-100 mL，天津百奥泰科技发展有限公司），牛肉净膏液，硫酸铜（JK000740，天津百奥泰科技发展有限公司），硫酸亚铁（KM0-103，天津艾利安电子科技有限公司），高锰酸钾（JL5857，天津市河西区顺鑫意发五金交电），甲醛（JK000394，天津百奥泰科技发展有限公司）。

将硫酸铜和硫酸亚铁各自用蒸馏水溶解，再按5∶2的比例混合，获得硫酸铜和硫酸亚铁合 剂[21-22]。高锰酸钾、福尔马林根据试验要求配置成不同浓度溶液备用。

1.2 试验方法

1.2.1 小瓜虫的离体培养与观察

收集病鱼体表的多子小瓜虫，使用细胞培养瓶进行单克隆培养。加入20 mL牛肉净膏液和2 mL小牛血清[23]，轻微振荡后，放至24 ℃生化培养箱中，进行单克隆大量繁殖[7]。定时用倒置显微镜观察多子小瓜虫的生长情况，当水体中虫体密度超过30 000 ind/mL时，进行攻毒试验。

1.2.2 三种药物的浓度设置

经预试验，本试验硫酸铜和硫酸亚铁合剂 （5∶2）设置的药物质量浓度分别是0、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/L，共5个，高锰酸钾浓度分别是0、1、2、4、8 mg/L，共5个，福尔马林浓度分别是0、30、60、90、120 mg/L，共5个。每个浓度梯度组设三个平行，每组药品各设生理盐水组作为空白对照组。分别在0、0.5、1.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h，进行全板计数，每孔计数3次。

1.2.3 数据处理分析

在倒置显微镜下观察各组药物作用下离体多子小瓜虫的死亡数量并计算其死亡率（%），死亡率取平均值后利用SPSS 16.0统计软件对不同试验组的数据进行单因素方差分析，并用LSD法多重比较，试验结果以平均数±标准差（mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 空白对照组多子小瓜虫的生长率

试验表明，在不加任何药物，即正常生长的情况下，多子小瓜虫的个体数量随着时间推移逐渐增加，基本没有死亡，多子小瓜虫的生长率基本呈现正增长趋势。

2.2 硫酸铜和硫酸亚铁合剂（5∶2）对离体多子小瓜虫的急性毒性研究

由表1可知，在较低浓度的硫酸铜和硫酸亚铁合剂（0.7 mg/L）作用攻毒后的12.0 h之内，离体小瓜虫的死亡率呈增长趋势，在12.0 h时达到33.30%，但是随着时间推移，离体小瓜虫的死亡率开始出现下降和起伏，并于48.0 h后达到最低值，仅为11.10%。当药物以较高浓度（1.4、2.8 mg/L）作用时，试验各时段的离体小瓜虫死亡率均呈现上升趋势，在药物作用浓度达到2.8 mg/L时，48.0 h后离体小瓜虫的死亡率高达90.00%，但仍不能全部死亡，当药物作用浓度达到最高浓度（5.6 mg/L），0.5 h时离体小瓜虫的死亡率为31.10%，显著高于其他作用浓度相同时间下的死亡率，随后各时间段的死亡率一直处于上升阶段；历经48.0 h后，其死亡率达100.00%。结合以上数据表明，硫酸铜和硫酸亚铁合剂的浓度为5.6 mg/L时，其作用于多子小瓜虫是最适宜的，离体小瓜虫全部致死。由表1可知，0.5 h时高浓度试验组无显著差异。药物作用1.0 h时，空白对照组与高浓度5.6 mg/L的试验组之间具有显著差异（＜ 0.05）。在12.0 h时空白对照组和其他浓度试验组均存在显著差异（＜0.05）。24 h时，0.7 mg/L浓度组和其他高浓度组均存在显著差异（＜0.05）。36.0 h时，各试验组之间均存在显著差异（＜0.05）。48.0 h时0.7mg/L浓度组和其他高浓度组均存在显著差异（＜0.05）。

表1 硫酸铜和硫酸亚铁合剂对离体多子小瓜虫的死亡率及其平均值比较分析

注：表中字母不同表示相同时间不同浓度差异显著（＜0.05）。下同

2.3 高锰酸钾溶液对离体多子小瓜虫的急性毒性研究

由表2可知，离体小瓜虫对高锰酸钾药物较为敏感，药物作用1 h时，4个试验组均有死亡。当浓度低于4 mg/L时，攻毒后的1～36 h内，其死亡率高低变化。当高锰酸钾溶液作用浓度为 1 mg/L时，药物对多子小瓜虫作用的死亡率均不足50.00%。作用浓度为2 mg/L时，24 h多子小瓜虫的死亡率可达53.30%。作用浓度为4 mg/L时，48 h虽不能全部杀死多子小瓜虫，但多子小瓜 虫的死亡率已提高至94.40%。而当药物浓度为 8 mg/L时，多子小瓜虫的死亡率呈上升趋势，多子小瓜虫于48 h时全部死亡。

表2 高锰酸钾对离体多子小瓜虫的死亡率及其平均值比较分析

表2显示作用浓度为1 mg/L的试验组中药物对小瓜虫的作用效果随时间增加而降低，在作用浓度为2、4、8 mg/L的试验组中随着作用时间延长，高锰酸钾溶液对离体小瓜虫的作用效果增强，多子小瓜虫的死亡率增加。当药物作用0.5 h时，在1、2、4、8 mg/L浓度的试验组与对照组差异均不显著（＞0.05）。当药物作用1 h时，空白对照组与药物浓度为2、4、8 mg/L时差异均显著（＜ 0.05）。随着作用时间继续增加，药物浓度为2、4、8 mg/L时与空白对照组间差异均显著（＜ 0.05）。当高锰酸钾溶液作用浓度为1 mg/L时，在12 h内能刺激多子小瓜虫生长，但其增长速度较慢。

2.4 福尔马林对离体小瓜虫的急性毒性研究

由表3可知，当福尔马林作用浓度为30 mg/L时，在0.5～1.0 h，离体小瓜虫死亡率显著上升，1 h时达到54.4%，但随着攻毒时间增加，其死亡率逐渐下降，48 h时死亡率下降至22.20%，和攻毒0.5 h时的死亡率相同，以此推断较低浓度的福尔马林对多子小瓜虫没有显著的作用效果。当福尔马林作用浓度大于60 mg/L时才具有明显杀虫效果，浓度大于90 mg/L时作用效果明显。当福尔马林作用浓度为60、90、120 mg/L时，随时间增长，多子小瓜虫的死亡率不断上升。在1 h时，浓度为120 mg/L的试验组与空白对照组差异显著 （＜0.05）。12 h时空白对照组和30 mg/L试验组的多子小瓜虫死亡率与60、90、120 mg/L 3组试验组之间差异显著（＜0.05）。24、36、48 h空白对照组与其他试验组均有显著差异（＜0.05）。当药物作用浓度为30 mg/L时，福尔马林对多子小瓜虫的杀灭效果在1 h时达到顶峰，随后作用效果开始下降。

表3 福尔马林对离体多子小瓜虫的死亡率及其平均值比较分析

3 讨论

3.1 硫酸铜和硫酸亚铁合剂（5∶2）对离体小瓜虫的杀死效果

小瓜虫病是目前国内外最为棘手的鱼类疾病之一[14]，小瓜虫通过寄生于鱼类，引起其体表各组织充血并减低免疫力，导致鱼类被细菌、病毒感染，造成大批死亡，严重影响鱼类养殖生产[18]。硫酸铜、硫酸亚铁合剂对多子小瓜虫体外培养攻毒试验中，用0.7 mg/L的硫酸铜和硫酸亚铁合剂作用于小瓜虫后，12.0 h后虫子数量不断升高，多子小瓜虫死亡率下降，说明低浓度的硫酸铜和硫酸亚铁合剂作用下不能有效抑制多子小瓜虫生长，更达不到杀灭多子小瓜虫的效果。当作用浓度为1.4 mg/L时，48.0 h时多子小瓜虫的死亡率可达78.90%。当作用浓度为2.8 mg/L时，药物作用48.0 h内可以杀死高达90.00%的多子小瓜虫。硫酸铜和硫酸亚铁合剂作用时能杀死寄生在鱼类体表的许多寄生虫，杀灭体外寄生虫时硫酸铜起主要作用，而硫酸亚铁一般为辅助药物具有收敛作用，辅助硫酸铜杀死虫体[24]。一般情况下，通常使用硫酸亚铁辅助硫酸铜杀灭一些比较难杀灭的寄生虫。硫酸铜和硫酸亚铁合剂在作用于小瓜虫过程中，Cu2＋与虫体蛋白质形成螯合物，使蛋白质变性、沉淀，继而使多子小瓜虫体内的酶失去活力，影响小瓜虫的正常生长，从而达到杀死多子小瓜虫的目的[25]。李光照[26]认为在防治车轮虫（）病时，选择全池泼洒0.5 g/m3硫酸铜和0.2 g/m3硫酸亚铁合剂的使用剂量是安全有效的。张涛等[27]在对四种常用水产药物对菲牛蛭（）急性毒性的研究中阐明硫酸铜、硫酸亚铁合剂及高锰酸钾溶液的半致死浓度会随时间的延长而降低。硫酸铜、硫酸亚铁合剂对菲牛蛭杀死效果要比高锰酸钾溶液明显，其半致死浓度分别为1.91 mg/L和4.17 mg/L，安全浓度为0.59 mg/L和0.62 mg/L。LINK等[28]研究铜离子对鱼类多子小瓜虫致死浓度的确定，铜离子对小瓜虫LC50为0.288 mg/L。因此硫酸铜的实际用量（以CuSO4·5H2O计算）不能低于1.14 mg/L。黄斌等[18]在不同药物对金鱼小瓜虫病的防治效果的试验表明只有当硫酸铜、硫酸亚铁合剂浓度大于1.2 mg/L（半致死浓度）时，对多子小瓜虫才有杀死作用。在本试验中，通过硫酸铜、硫酸亚铁合剂对多子小瓜虫体外培养的攻毒试验，用0.7 mg/L硫酸铜、硫酸亚铁合剂作用于小瓜虫，12 h后虫子数量不断升高，多子小瓜虫死亡率下降，说明低于半致死浓度的硫酸铜和硫酸亚铁合剂不能起到完全毒杀离体多子小瓜虫的效果。

3.2 高锰酸钾溶液对离体小瓜虫的杀死效果

高锰酸钾又称灰猛氧、过锰酸钾等，是一种强氧化剂，可氧化细菌表面的氧化膜，使细菌溶解，蛋白活性失活，用来杀灭多种寄生虫和病害生物[29-31]，或利用鱼类与高锰酸钾短时间接触来防止鱼类感染病原[32]。本试验研究发现，进行高锰酸钾对离体小瓜虫的攻毒试验时，当作用浓度为 1 mg/L时，高锰酸钾溶液对多子小瓜虫没有致死作用，反而促进虫体的生长。当作用浓度为2 mg/L时，12 h时高锰酸钾没有明显杀死离体小瓜虫的效果，在24 h时多子小瓜虫的死亡率才43.30%，当作用浓度为4 mg/L时，48 h时多子小瓜虫的死亡率可达94.40%。陈达丽等[1]在杀灭离体小瓜虫的药物试验中提到，高锰酸钾浓度在2～5 mg/L时，有杀死多子小瓜虫作用，与本试验结果基本吻合。当作用浓度为8 mg/L时，药物作用效果随时间增加而增强，48 h时，多子小瓜虫的死亡率为100.00%。

3.3 福尔马林对离体小瓜虫的杀死效果

30%～40%的甲醛水溶液称为福尔马林，作用于细胞时能阻止细胞核蛋白的合成，抑制细胞核和细胞浆的合成以及细胞分裂，影响细胞正常生命活动，使微生物死亡。福尔马林能有效杀死细菌繁殖体，也能杀死芽孢以及抵抗力强的结核杆菌、病毒等[33-36]。福尔马林作用浓度为60 mg/L时，48 h能杀死82.2%的小瓜虫。作用浓度为90 mg/L的药物可以在48 h杀死98.9%的小瓜虫，当福尔马林浓度大于60 mg/L时才达到杀死多子小瓜虫的效果。高莉霞等[37]研究化学药物对鳜鱼车轮虫（）病、斜管虫（）病的影响与防治时，发现低浓度硫酸铜和硫酸亚铁合剂无有效作用，高于2.8 mg/L时饵料鱼全部死亡，因此福尔马林对车轮虫病、斜管虫病的治疗效果要优于硫酸铜以及硫酸铜和硫酸亚铁合剂。黄斌等[18]在不同药物对金鱼小瓜虫病的防治效果研究中，使用福尔马林（40～50 mg/L）作用100～125 min时对多子小瓜虫病的防治效果较好。

4 结论

通过比较硫酸铜和硫酸亚铁合剂、高锰酸钾、福尔马林对离体小瓜虫的作用效果，发现三种化学药物对多子小瓜虫都有一定的抑制作用，随着药物浓度升高和药浴时间延长，存活的小瓜虫越来越少，死亡率升高。由死亡率计算得出，多子小瓜虫对三种化学药物的敏感性大小依次为：硫酸铜和硫酸亚铁合剂＞高锰酸钾溶液＞福尔马林。

[1] 陈达丽，张其中.杀灭离体小瓜虫的药物试验[J].淡水渔业，2005（1）：45-46.

[2] 闫春梅，郑伟.小瓜虫病流行病学调查及防治[J].吉林水利，2014（11）：53-55.

[3] 王兴仿，庄耿，谢承西，等.小瓜虫的危害及生活史[J].科学养鱼，2017（7）：89.

[4] FOUQUET D.Uneespeee dinfusoires parasites des poisons deau douce[J].Archde Zool Experot Gen，1876，5：157-165.

[5] 庞显炳.淡水名优鱼小瓜虫病病因分析及防治探讨[J].科学养鱼，2000（9）：17-18.

[6] 宋飞彪，王伟洪，吴礼广，等.多子小瓜虫生态特性研究现状[J].河北渔业，2012（5）：45-48.

[7] 倪达书，李连祥.多子小瓜虫的形态、生活史及其防治方法和一新种的描述[J].水生生物学集刊，1960（2）：197-225.

[8] 张素芳，马成伦.多子小瓜虫的繁殖、离体存活、感染及病理[J].淡水渔业，1986（5）：32-34，40.

[9] 吴海峰，顾翔.浅谈小瓜虫病的防治[J].科学养鱼，2018（4）：91.

[10] 曾庆雄，方伟，孙秀秀，等.淡水鱼类小瓜虫病[J].海洋与渔业，2015（6）：42.

[11] 张其中，张占会，陈达丽，等.水温对多子小瓜虫孵化及幼虫活力的影响[J].生态科学，2010，29（2）：116-120.

[12] 甘维熊，邓龙君，周辉霞.淡水鱼类多子小瓜虫病研究进展[J].科学养鱼，2013（12）：56-58.

[13] 王兴仿，庄耿，谢承西，等.小瓜虫感染鱼体及防 治[J].科学养鱼，2017（8）：89.

[14] DICKERSON H W，FINDLY R C.Immunity toinfections in fish: A synopsis[J].Developmental and Comparative Immunology，2014，43（2）：290-299.

[15] 章海鑫，王静娟，张爱芳，等.淡水小瓜虫的研究现状[J].江西水产科技，2016（2）：38-43.

[16] 冯豆，蔡婷，邓剑壕，等.小瓜虫病及其防治方法的概述[J].水产养殖，2017，38（6）：44-46.

[17] 闫春梅，郑伟.小瓜虫病流行病学调查及防治[J].吉林水利，2014（11）：53-55.

[18] 黄斌，常红军.不同药物对金鱼小瓜虫病的防治效 果[J].水产科学，2003（2）：18-20.

[19] LIU Y M，ZHANG Q Z，XU D H，et al.Antiparasitic efficacy of curcumin fromagainstin grass carp[J].Veterinary Parasitology，2017，236：128-136.

[20] SEYED J A，SEYED S M，HOOMAN R H，et al.The in vitro and in vivo effect of tannic acid onin zebrafish（）to treat ichthyophthiriasis[J].Journal of Fish Diseases，2018，41（7）：1-10.

[21] 常藕琴，石存斌，吴淑勤.硫酸铜中毒对剑尾鱼肝脏和鳃损伤的病理学研究[J].广东农业科学，2012，39（21）：136-138，237.

[22] 姜礼燔.硫酸铜在防治鱼病中的应用[J].水产科技情报，1989（4）：106-108.

[23] 郭碧琳.小瓜虫体外培养研究及青蒿琥酯等药物对小瓜虫的影响[D].福州：福建农林大学，2007.

[24] 王华荣，雍林和.如何正确使用硫酸铜和硫酸亚铁合剂[J].渔业致富指南，2012（21）：59-60.

[25] 田喆，张鼎元，朱晓静，等.黄姑鱼幼鱼对硫酸铜和甲醛的耐受性研究[J].宁波大学学报（理工版），2018，31（2）：8-12.

[26] 李光照.巧施硫酸铜、硫酸亚铁合剂治疗车轮虫病[J].科学养鱼，2013（8）：64-65.

[27] 张涛，于翔，龚元，等.四种常用水产药物对菲牛蛭急性毒性的研究[J].水产学杂志，2014，27（3）：52-56.

[28] LING K H，SIN Y M，LAM T J.Effect of copper sulphate on ichthyophthiriasis（white spot disease）in goldfish （）[J].Aquaculture，1993，118（1-2）：1-35.

[29] 郭朝良，王华冰.观赏鱼常见疾病预防及常用药物的使用方法[J].山东畜牧兽医，2017，38（1）：56-57.

[30] 陈健荣，刘利平.4种常用渔药对花鳗鲡幼鱼的急性 毒性[J].水产科学，2018，37（2）：233-238.

[31] 张怀礼，张红梅.福尔马林在水产养殖中用途广[J].渔业致富指南，2003（7）：26.

[32] 杨星，张美彦，李小义，等.4种常用水产药物对鲈 鲤鱼苗的急性毒性效应[J].贵州农业科学，2018，46（11）：87-90.

[33] 缑祖新.甲醛免疫毒性的研究综述[J].河南教育学院学报（自然科学版），2009，18（2）：19-20.

[34] 侯吉伦，刘海金，范兆廷.福尔马林在水产养殖生产中的应用及毒副作用的预防[J].东北农业大学学报，2009，40（9）：126-130.

[35] 章剑，赵淑梅.福尔马林在水产养殖中的应用[J].渔业现代化，2001（5）：18-19.

[36] 张效平，商宝娣，李小义，等.3种常用药物对坏鳃 指环虫的杀灭效果[J].江苏农业科学，2018，46（20）：171-174.

[37] 高莉霞，朱思华.福尔马林对鳜鱼苗种车轮虫、斜管虫病的防治研究[J].淡水渔业，1992（6）：8-11.

Study on the sensitivity ofto three chemical drugs

LI Xuehan, QI HongliCorrespondingAuthor, Lü Xianglin, Yang Guang

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In this study,isolated fromwas in vitro monoclonal culture, using mixture of copper sulfate and ferrous sulfate（5∶2）, aqueous solution of potassium permanganate and formalin to explore the mortality to.The results showed that the concentration of the three drugs is positively correlated with the mortality of, and 5.6 mg/L of copper sulfate and ferrous sulfate mixture, 8 mg/L potassium permanganate aqueous solution and 120 mg/L formalin can kill all of the.The sensitivity of theto these three chemical drugs: Copper sulfate and Ferrous sulfate mixture＞Potassium permanganate aqueous solution＞Formalin.The research results provide corresponding theoretical data and experimental basis for the treatment and prevention ofdisease to a certain extent.

; copper sulfate and ferrous sulfate mixture（5∶2）; potassium permanganate aqueous solution; formalin; sensitivity

1008-5394（2021）03-0069-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.015

S931.1

A

2019-09-30

天津市科委自然基金项目（17JCYBJC29800，15JCYBJC23900）；中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室开放课题（KLM2018003）

李雪菡（1994—），女，硕士在读，主要从事原生动物学的研究。E-mail：1552897312@qq.com。

齐红莉（1978—），女，副教授，硕士，主要从事水生态毒理学及原生动物学的研究。E-mail：qihl2000@163.com。

责任编辑：张爱婷