Fascin1与E-cadherin在胃癌中的表达与意义

赵文兴 王 振 李 磊 于国庆 郑 臻 史志猛

1.泰安市中心医院普外二科，山东 泰安 271000；2.泰安市中心医院消化内科，山东 泰安 271000；3.山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生处，山东 泰安 271016

胃癌目前是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2013年，全球大约84.1万人口死于胃癌［1］；胃癌在我国发病及死亡人数仅次于肺癌，居于第二位［2-3］；胃癌易发生转移，且转移是导致死亡率高的重要原因。胃癌的转移涉及到多阶段、多基因变化与多途径的病变演变过程，包括Fascin1在内的细胞骨架蛋白参与了此过程［4］。Fascin1是一种肌动蛋白结合蛋白，表达于人类多种肿瘤中，但在大多数正常上皮中不表达，Fascin1促进了胃癌等肿瘤细胞丝状伪足的形成、迁移和侵袭过程，与肿瘤的转移有关［5］。目前已证实胃癌的转移与上皮-间质转化（pithelialmesenchymal transition，EMT）、肿瘤干细胞、血管内皮生长因子等因素有关［6-8］。EMT是指上皮细胞在相关因子的刺激下向间质细胞表型转化的过程，上皮细胞EMT化后具有间质细胞特性，进而导致细胞侵袭转移能力增强［9］。Fascin1是否通过促进胃癌细胞的EMT过程进而导致胃癌侵袭转移，目前尚无相关报道。上皮型钙黏附蛋白（E-cadherin）是EMT的标志蛋白，因此检测了人胃癌及癌旁组织中Fascin1与E-cadherin的表达情况，并进一步研究了胃癌细胞中Fascin1与E-cadherin的调控关系，从而为胃癌的转移机制研究作进一步的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人胃癌组织芯片（购自于西安艾莉娜公司），人胃癌细胞SGC-7901（购自于中科院上海细胞库），小鼠抗人Fascin1抗体（R&D公司），兔抗人E-Cadherin抗体（CST公司），小鼠抗人β-actin抗体（CST公司），Control-siRNA、Fascin1-siRNA（Santa Cruz公司），Transwell小室（康宁公司），Matrigel胶（BD公司），Lipo6000™转染试剂（碧云天公司），胎牛血清、RPMI 1640培养基（GIBCO公司），SABC免疫组化试剂盒（博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 SABC法检测胃癌及癌旁组织中Fascin1与E-cadherin的表达情况，具体步骤参照SABC试剂盒说明书进行。应用阳性细胞比例与着色强度综合计分法判断阳性结果，染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。阳性细胞率计分：阳性细胞<5%为0分，5%～25%为1分，26%～75%为2分，>75%为3分。两种计分相加；<6分为阴性，≥6分为阳性［10］。

1.2.2 细胞培养及转染细胞接种于六孔板中，在5%CO2、37℃培养箱中培养，细胞密度达30%～40%时进行Fascin1-siRNA、Control-siRNA转染，具体步骤参考Lipo6000™转染试剂说明书。

1.2.3 RT-PCR Trizol法提取胃癌SGC-7901细胞中RNA，逆转录成cDNA，聚合酶链式反应（PCR反应扩增），琼脂糖凝胶电泳及结果观察。Fascin1的引物为5′-GCCAGGGTATGGACCTGTCTG-3′和5′-CACGCCACTCGATGTCAAAGTA-3′，E-cadherin的引物为5'-TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC-3'和5′-TCCTATCTTGGGCAAAGCAACTG-3′，内参β-actin的引物为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3和5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。

1.2.4 蛋白质免疫印迹BCA法检测细胞蛋白浓度，取50μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到NC膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育12 h，二 抗 室 温 孵 育1 h，ECL显 色，Bio-Rad ChemiDoc MP凝胶系统检测阳性信号。采用β-actin作为内参。

1.2.5 Transwell迁移与侵袭实验 Transwell迁移实验：将100μl无血清培养基稀释的细胞（约5万个）加入到小室上层，下室加入800μl含血清的培养液；Transwell侵袭实验：小室预先铺有Matrigel胶，将100μl无血清培养基稀释的细胞（约2万个）加入到小室上层；培养24 h，取出小室，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察（400倍视野）。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组Fascin1、E-cadherin蛋白表达情况

Fascin1主要定位于细胞质，其在胃癌组织中的表达阳性率为42.2%（38/90），而在癌旁组织中阳性率为0（0/90），差异有统计学意义（P<0.001）；E-cadherin阳性颗粒主要定位于细胞膜与细胞质，其在胃癌组织中的表达阳性率为37.8%（34/90），而癌旁正常组织中阳性率为90%（81/90），差异有统计学意义（P<0.001）。见图1。

图1 Fascin1与E-cadherin在胃癌及癌旁组织中的表达情况

2.2 Fascin1、E-cadherin在胃癌组织中的表达及与临床病理参数的关系

Fascin1在胃癌组织中的表达与性别、年龄无关，与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度呈正相关；E-cadherin在胃癌组织中的表达与性别、年龄无关，与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度呈负相关，见表1。

表1 Fascin1、E-cadherin在胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系

2.3 胃癌组织中Fascin1与E-cadherin表达的相关性

Fascin1与E-cadherin在胃癌中共同表达阳性者7例，共同表达阴性者25例，Fascin1表达阳性而E-cadherin表达阴性者31例，Fascin1表达阴性而E-cadherin表达阳性者27例，两者在胃癌组织中的表达呈显著负相关（r=－0.341，P=0.001）。

2.4 SGC-7901细胞中，Fascin1对E-cadherin mRNA及蛋白表达水平的影响

RT-PCR结果显示，SGC-7901细胞转染Fascin1-siRNA后，Fascin1 mRNA表达水平明显降低，E-cadherin mRNA水平明显增高，而Normal组（正常组）与Control-siRNA组没有明显变化（F=32.49，P=0.001；F=20.095，P=0.002）。见图2。

蛋白质免疫印迹结果显示，SGC-7901细胞转染Fascin1-siRNA后，Fascin1蛋白表达水平明显降低，E-cadherin蛋白水平明显增高，而Normal组与Control-siRNA组没有明显变化（F=15.1，P=0.005；F=22.509，P=0.002），见图2。由此可见Fascin1可以负向调控E-cadherin的表达。

2.5 Transwell迁移与侵袭实验

胃癌SGC-7901细胞分别转染Fascin1-siRNA与Control-siRNA24 h后，相比Control-siRNA组，Fascin1-siRNA组细胞的迁移及侵袭能力明显降低（t=4.821，P=0.009；t=5.429，P=0.006）。见图3。

3 讨 论

胃癌是目前世界上最常见的第四种恶性肿瘤，每年有100万人诊断为胃癌，每年70万人死于胃癌［11-12］。胃癌患者死亡的主要原因是转移，因此，了解胃癌细胞从原发肿瘤逃逸、侵袭周围组织、经过淋巴管播散、远处转移成为胃癌研究的焦点。为了局部浸润和转移，肿瘤细胞具有较高的运动性和侵袭性，细胞具有明显的形态特征（如伸长、极化、细胞突起的出现等）以及细胞与细胞接触的紊乱［13］。所有上述改变均与细胞骨架（尤其肌动蛋白）的改变和重排有关［14］。作为一种丝状肌动蛋白结合蛋白，Fascin1与肿瘤细胞的丝状伪足形成、细胞粘附及运动迁移等生物学行为有关，进而影响肿瘤细胞的侵袭转移［15］。

图2 Fascin1对E-cadherin mRNA及蛋白表达水平的影响

图3 Fascin1对SGC-7901运动能力的影响

Fascin1是FSCN1编码的肌动蛋白集束蛋白，与恶性肿瘤的增殖、迁移和转移呈正相关，Fascin1在胃癌中的表达明显高于正常黏膜组织［16］。本研究中，Fascin1在胃癌组织中明显高表达，且表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及浸润深度呈显著正相关，说明Fascin1与胃癌的侵袭转移有关。且在人胃癌SGC-7901细胞中证实了敲低Fascin1的表达水平可以降低细胞的侵袭迁移能力，进一步说明了Fascin1与胃癌转移有关。目前Fascin1在胃癌转移中的分子机制尚不明确。

上皮细胞具有间充质细胞特征的过程称为上皮间质转换（EMT）［17］，EMT过程中，上皮细胞极性丢失，伴随着细胞之间接触减少，细胞间的连接随之破坏，细胞骨架重塑，因此表现为E-cadherin表达下调和波形蛋白表达上调［18］。EMT与肿瘤转移有关，研究已证实EMT过程涉及了胃癌的侵袭转移［19-20］。E-cadherin是EMT的标志性分子，也是控制正常细胞粘附和组织完整性的重要分子，E-cadherin的丢失与胃癌的进展、侵袭和转移有关［21-22］。本研究中，E-cadherin在胃癌中阳性表达率明显低于癌旁组织，且在胃癌中表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及浸润深度呈负相关。

因此，本研究检测了胃癌组织中Fascin1与E-cadherin的表达情况，且经相关性分析得出二者在胃癌中表达呈显著负相关；进一步行细胞实验得出，在胃癌细胞中，Fascin1可以负向调控E-cadherin的表达，且Fascin1敲低后胃癌细胞的侵袭迁移能力下降，综上，可以推测出Fascin1可能参与了胃癌细胞EMT过程进而调节胃癌的转移。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突