纳米微针导入大豆提取液联合调Q1064 nm激光对黄褐斑豚鼠模型表皮黑素细胞的影响

乌兰托雅，李睿亚

内蒙古自治区人民医院皮肤科，内蒙古 呼和浩特 010017

黄褐斑是一种后天获得性、慢性发病的色素增加性皮肤病，发病机制尚不完全清楚，考虑与紫外线照射、内分泌因素、自由基损伤、炎症反应、色素代谢异常、皮肤屏障功能紊乱、皮肤血管因素、遗传易感性等多种致病因素相关。黄褐斑的治疗，现以局部治疗多见，外用药物配合激光治疗效果较肯定。大豆富含异黄酮、皂苷、多肽等生理活性物质，在抗氧化、清除自由基、预防骨质疏松及心血管疾病等方面具有重要价值［1-3］。皮肤屏障对于维持皮肤正常生理功能极为重要，但会影响外用药物透皮吸收。为了提高局部药物的吸收率，药物透皮技术应运而生。新兴透皮技术纳米微针（简称纳晶），其高晶硅纳米级针尖可穿透角质层，在表皮上建立给药通道，而不损伤真皮层，吸收效果提高10～20倍［4］。激光治疗黄褐斑是一把“双刃剑”，既要充分发挥祛除色斑优势，又要避免术后色素沉着，选择适宜的治疗参数，避免术后炎症反应，是激光治疗的关键所在［5］。大量临床研究发现，采用大光斑低能量调Q1064 nm多次治疗黄褐斑效果显著［6］，可有效调节氧化应激状态，比强脉冲光临床疗效更显著［7］，是近几年广受推崇的治疗方法。

鉴于此，本研究拟联合运用纳米微针导入大豆提取液和调Q1064 nm 激光的方式治疗黄褐斑豚鼠模型，对其治疗前、后进行实验观察，评估治疗效果，为黄褐斑治疗提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

成年雌性豚鼠，60 只，清洁级，体重320～380 g。购于北京海淀区兴隆实验动物养殖场，许可证号：SCXK（京）2016-0003。

SH2B 紫外线光疗仪（上海希格玛公司），黄体酮注射液（浙江仙琚制药），大豆提取液（内蒙古医科大学基础实验室制备，采用低温萃取法获得的液体，需低温保存），Q 开关1064nm（Nd：YAG）激光治疗机（吉林科英），纳米晶片促渗仪（苏州纳通生物），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程），黑色素瘤鼠单克隆抗体Melan A（北京博奥森），Olympus 光学显微镜（Olympus 公司，日本），CMIAS 多功能真彩色病理图像分析系统（空总医院与北航大学共同研制）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

60 只豚鼠随机抽取12 只，作为A 组（空白对照组），不造模，不治疗；剩余48 只为B 组（模型制备组）。造模45 d，随机分为4 组：分别为B1 组（模型对照组）不治疗；B2 组（激光治疗组）相同参数激光治疗，每周1 次，治疗5 次；B3 组（大豆治疗组）纳晶促渗仪导入大豆提取液，每日1 次，治疗5 周；B4 组（大豆联合激光组）两种方式联合治疗。

1.2.2 黄褐斑豚鼠模型制备

脱毛采用上蜡法［8］，豚鼠背部脱毛范围约4 cm×4 cm。采用“紫外线照射法［7］”+“黄体酮冲击法［9］”制备模型，豚鼠置于固定笼内，与光源的距离为20 cm，连接电源打开SH2B 紫外线光疗仪，每日照射1次，每次30 min，连续45 d。黄体酮注射液配置成安全剂量2 mL/kg，豚鼠后肢消毒后肌肉注射，每日1次，双后肢交替注射，连续45 d。

1.2.3 模型治疗

调Q1064 nm 激光：波长1 064 nm，光斑8 mm，能量密度1～2 J/cm2［10-11］，助手固定好豚鼠治疗区域，在治疗区域从左至右均匀扫描2遍，光斑重叠不超过10%，皮肤轻微发红停止治疗，每周1次，治疗5次，每次约1 min。

纳米微针导入方法：清洁豚鼠治疗区域，纳米晶片安装在纳晶促渗仪头部，将大豆提取液（20 mg/mL）垂直滴于纳米晶片上，开启电源，在治疗区域从左至右平行滑动且垂直按摩2遍，每日1次，治疗5周。

1.2.4 取材

在造模后（治疗前）、治疗1周即刻、治疗5周即刻、治疗结束3周取材。取材前1 d脱毛，豚鼠腹腔注射10%水合氯醛水溶液（安全剂量0.3 mL/100g［12-14］），麻醉15 min 后，助手固定好豚鼠，用无菌手术器械迅速在皮损处取适量的皮肤组织。

1.2.5 各项指标观测

表观指标：观察豚鼠背部实验区域皮肤的变化，如色斑颜色深浅、面积大小、毛发光泽度。

皮肤CT：取材前用皮肤CT逐层扫描治疗区域皮肤，观察表、真皮变化，特别是表皮黑素细胞（melanocyte，MC）、黑素颗粒等。

皮肤SOD 活性、MDA 水平的测定：豚鼠背部皮肤取约5 mg组织，用4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸去水分，组织切碎待用。按说明书配制实验试剂，分别用羟胺法及硫代巴比妥酸测定。

免疫组化检测Melan A：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复阻断内源性过氧化氢酶，一抗Melan A 抗体4 ℃过夜孵育，二抗山羊抗兔IgG 抗体室温孵育，DAB显色，苏木素复染，不同浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

MC相关数据：显微镜物镜下，每张片随机选择不同视野，用病理图像分析系统对黑素阳性目标图像采集、存储、定量分析，记录各组不同时期MC 阳性目标数量。

1.3 统计学方法

使用SPSS22.0对各组数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，经检验均符合正态分布，采用方差分析进行比较，组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组表观指标变化

造模后B1、B2、B3、B4 组背部造模区域出现不规则形的黑褐色斑片，与A组对比鲜明，提示造模成功。A 组、B1 组在治疗前、治疗1 周即刻、治疗5 周即刻、治疗结束3周未见明显变化。

治疗后B4 组色斑基本消退，B4 组治疗区域近似于A组背部皮肤，疗效明显，B2、B3组可见散在分布色斑，颜色较前变浅。各组治疗结束3 周均未出现色沉及复发（图1）。

图1 各治疗组不同时期皮肤表现

2.2 各组皮肤CT结果

与B1 组相比，B4 组的MC 和黑素颗粒显著减少，B2、B3 组的MC 和黑素颗粒也减少。治疗结束后，B2、B3、B4组豚鼠的表皮较治疗前变薄，颗粒层含少量黑素颗粒，基底层黑素含量显著降低，可见散在分布的MC，黑素颗粒显著减少，偶可见树枝状细胞，真皮浅层可见少许黑素颗粒（图2）。

图2 各治疗组不同时期皮肤CT表现

2.3 各组皮肤SOD活力、MDA含量的变化

B2、B3、B4组治疗前、后，SOD活力及MDA含量均有差异（P＜0.05），说明3 组治疗方法均有疗效。通过方差分析，两两组间比较均有差异（P＜0.05），B4组联合治疗疗效最显著（表1、2）。

表1 各组不同时期豚鼠皮肤SOD活力变化 （U/mg，）

表1 各组不同时期豚鼠皮肤SOD活力变化 （U/mg，）

与治疗前比较，*P ＜0.05；与A组比较，#P ＜0.05；与B1组比较，△P ＜0.05。

2.4 各组Melan A免疫组化结果

B1组镜下可见阳性MC、黑素颗粒较多，呈强阳性反应；基底细胞层可见分布密集的阳性MC，MC胞体及胞核较大，伴核上移；基底细胞层以上可见大量呈线状或带状致密的黑素颗粒，着色较深。B2、B3 组镜下可见阳性MC、黑素颗粒减少；基底细胞层偶可见少量棕黄色MC；基底细胞层以上偶可见少量的黑素颗粒。B4组镜下可见阳性MC、黑素颗粒数量显著减少，基底细胞层偶可见少量呈棕黄色MC和极少量的黑素颗粒（图3）。

图3 各治疗组不同时期皮肤Melan A免疫组化镜下表现（×400）

2.5 各组MC阳性目标数量比较

治疗5周即刻，B2、B3、B4组与治疗前相比，MC阳性目标数量都显著下降（P＜0.05）。B4 组MC 阳性目标数量变化最显著，差异有统计学意义（P＜0.05），因此B4组治疗效果最佳（表3）。

表3 各治疗组不同时期豚鼠皮肤MC阳性目标数量比较 （个/400倍视野，）

表3 各治疗组不同时期豚鼠皮肤MC阳性目标数量比较 （个/400倍视野，）

与治疗前比较，*P ＜0.05；与A组比较，#P ＜0.05；与B1组比较，△P ＜0.05。

3 讨论

MC 起源于神经嵴，是合成和分泌黑素的树枝状细胞。多项研究表明，黄褐斑病变区与周围正常皮肤相比，组织学特征为表皮变薄、表皮突变平，MC增大，且树突明显突出，MC功能活跃，黑素合成增加，基底层黑素显著增多，真皮浅层偶有游离黑素颗粒和噬黑素细胞，但MC数量有无变化尚不明确［15-17］。长期反复紫外线照射，能引起MC增殖和功能活跃，产生更多的黑素导致色素沉着［18-20］。雌激素和黄体酮增多刺激MC 致色斑形成。研究表明，豚鼠表皮内MC 和黑素小体分布与人体相似，若暴露紫外线下也有类似人体的色沉反应［21］。

皮肤CT 对黄褐斑的诊疗具有重要意义。检测优势包括：进行无创分型，根据镜下MC形态判断是否处于活跃期，从而指导治疗方法的选择。造模后皮肤CT镜下角化过度、棘层肥厚、基底层较多的MC呈簇状分布，黑素颗粒明显增多，弥漫分布呈强折光性粗大颗粒，形似“繁星点点”，也可见树枝状增殖活跃MC。真皮浅层可见少许黑素颗粒沉积，周围偶可见不规则性的噬黑素细胞。与A 组相比，造模后豚鼠基底层黑素含量显著增加，MC活跃，符合黄褐斑皮肤CT镜下特点，提示黄褐斑豚鼠模型造模成功。

表2 各组不同时期豚鼠皮肤MDA含量变化 （nmol/mg，）

表2 各组不同时期豚鼠皮肤MDA含量变化 （nmol/mg，）

与治疗前比较，*P ＜0.05；与A组比较，#P ＜0.05；与B1组比较，△P ＜0.05。

抗氧化剂是治疗黄褐斑的重要措施。本研究发现，与模型对照组相比，大豆治疗组皮损得到改善，皮肤中SOD活力显著升高，MDA含量显著降低，MC 阳性目标数量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明大豆提取液具有抗自由基作用，可以清除ROS，减轻紫外线损伤，修复受损细胞，抑制酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性，减少黑素形成等作用，与既往研究结果一致，但具体机制还有待进一步研究。配合纳米微针可以达到很好的渗透作用，单一治疗与联合治疗相比，效果欠佳，起效慢，需要长期外用，抑制MC活性、降低黑素形成的针对性不强。

本研究发现，造模后镜下可见基底细胞层MC及黑素颗粒较多，呈强阳性反应，联合治疗后，基底细胞层MC 及黑素颗粒数量显著减少；通过病理图像软件定量分析，联合治疗后与治疗前相比，MC阳性目标数量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明联合治疗效果优于单一治疗。

调Q1064 nm激光采用光爆破原理，靶组织选择性吸收激光后，将光能转化为热能，迅速膨胀碎裂，细小颗粒可被巨噬细胞吞噬、吸收。高能量激光治疗黄褐斑易出现炎症后色沉、水疱等不良反应［21-24］。本研究采用低能量激光，尽量避免术后不良反应，但同时色斑短期内并不容易被祛除，需要多次治疗逐渐达到治疗效果。黄褐斑易复发，单一激光治疗虽具有一定疗效，但复发率较高被多项研究证实［25］。因此，需要联合治疗提高患者满意度。

黄褐斑病程顽固，影响容貌美观，临床治疗的重点是在保证临床有效性的基础上，控制不良反应与复发。联合治疗后，MC阳性目标数量显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。本研究发现联合治疗较单一治疗效果更佳，为联合治疗提供动物实验依据。