裸花紫珠治疗慢性盆腔炎的网络药理学研究

王紫璇，薛晓鸥，孙 璐

北京中医药大学第一临床医学院，北京 100010

慢性盆腔炎（Chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是由女性内生殖器及周围结缔组织、盆腔腹膜发生慢性炎性病变所引起的症状，是目前育龄妇女最常见疾病之一，病情缠绵，易于复发。主要表现为慢性盆腔痛（常在劳累、性交后及月经前后加剧）、阴道分泌物增多［1］、不孕、异位妊娠［2］，以及月经量多、经期延长。近年来，其发病率呈上升趋势，严重影响妇女的身心健康和正常生活。临床上西医使用单一抗生素治疗CPID取得的疗效一般，且易产生耐药，副作用大，而采用中医中药治疗CPID，可有效地提高治愈率，不良反应少［3-4］。裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.）是海南的地道药材，为马鞭草科紫珠属植物的干燥叶，又名节节红、赶风柴、大斑鸠米、贼子叶等，性味苦、微辛、平；归脾、胃、肝经［5］。据《本草拾遗》记载，裸花紫珠有解诸毒的功效，有研究表明裸花紫珠提取物具有抗炎镇痛、止血、抗菌、散瘀消肿、增强机体免疫力等作用［6-7］。临床上裸花紫珠可用于各种炎症疾病的治疗，尤其广泛应用于妇科炎症，还可治疗各类出血、跌打瘀肿、疮毒溃烂等［8］。目前关于裸花紫珠作用机制的相关研究较少，本研究基于网络药理学方法，初步阐释裸花紫珠治疗CPID的作用机制。

1 资料与方法

1.1 裸花紫珠主要活性成分的收集与筛选

基于文献检索［9-11］，在中国知网（CNKI）、万方数据库中以“裸花紫珠”以及“化学成分”为主题，收集裸花紫珠的化学成分。通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索其化学成分的2D分子结构，以SDF格式保存，构建裸花紫珠化合物数据库。将分子结构的SDF文件导入SwissADME平台（http：//www.swissadme.ch/）进行胃肠道吸收（GIabsorption）、类药性（Druglikeness）分析。同时，查阅相关资料收集经实验证实的药效物质基础成分［11］，经分析后纳入主要活性成分。

1.2 活性成分靶点的预测和筛选

根据1.1项筛选的主要活性成分，利用Swiss Target-Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，将成分的分子结构SDF文件导入Swiss TargetPrediction，设置属性为homo sapiens，筛选其中possibility＞0.25的活性成分的靶基因进行收集。运用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）规范靶基因名称。

1.3 CPID靶基因的获取

通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/），以“chronic pelvic inflammatory disease”为关键词检索与CPID相关的基因靶点，筛选Relevence Score＞10的靶点进行收集，删除重复的靶点。将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，获得裸花紫珠活性成分治疗慢性盆腔炎的共同靶点，利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制韦恩图。

1.4 构建药物-活性成分-共同靶点网络

利用Cytoscape 3.7.2 软件，节点表示中药、成分、共同靶点，边表示活性成分与作用靶点之间的关系，构建药物-活性成分-共同靶点网络，更好地阐释裸花紫珠活性成分与慢性盆腔炎相关靶点之间的关系。

1.5 绘制PPI网络

将1.3项下得到的共同靶点导入String11.0数据库（https：//stringdb.org/），选择物种为“Homo sapiens”，绘制靶标蛋白质互相作用网络（PPI），下载TSV格式，并导入Cytoscape3.7.2 软件进行可视化。

1.6 GO富集分析及KEGG通路分析

将裸花紫珠治疗CPID的关键靶基因导入Metascape数据库（http://metascape.org）进行基因富集分析。Metascape整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等多个权威的数据资源，覆盖面较为广泛，且能很大程度地保证检索数据结果的时效性［12］。以P＜0.01作为具有统计差异的筛选条件，设置min overlap=3，Min Enrichment=1.5，对获取的靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和KEGG（KEGG pathway analysis）代谢通路富集分析。

2 结果

2.1 裸花紫珠活性成分的收集及靶点预测

基于文献检索，共收集144个化合物成分，经SwissADME平台筛选，将候选成分的2D分子结构导入SwissTargetPrediction平台进行靶蛋白预测，筛选其中possibility＞0.25的活性成分的靶蛋白，并去除数据库中没有预测靶点的活性成分，共获得裸花紫珠的主要活性成分20个，其中连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草苷虽口服利用度较低，但仍以主要化合物而得以保留（表1），删除重复值后共获得相关靶标蛋白116个。

表1 裸花紫珠的主要活性成分

2.2 CPID疾病靶点筛选结果

通过关键词检索GeneCards，筛选Relevance Score＞10的CPID相关靶点，OMIM检出534个相关靶点，经整合去重后，共纳入2 188个CPID相关靶点。利用venny2.1，将CPID相关靶点2 188个与所得的裸花紫珠预测靶点116个相映射，绘制韦恩图，得出裸花紫珠可能与CPID相关的靶点56个（图1）。在2.1项下，成分编号为zz20的香草醛（vanillin）对应的possibility＞0.25的靶点与疾病无交集，予以剔除，所以共纳入裸花紫珠治疗CPID的活性成分19个。

图1 裸花紫珠活性成分-CPID靶点交集韦恩图

2.3 绘制药物-活性成分-共同靶点网络

利用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-活性成分-共同靶点网络（图2），其中绿色LHZZ代表裸花紫珠，红色zz1～zz19代表活性成分，黄色代表靶蛋白。经统计degree值较高的有效成分为槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、芹菜素（apigenin），degree值分别为46、44、28。

图2 裸花紫珠治疗CPID的药物-活性成分-共同靶点网络图

2.4 绘制PPI图

将筛选得到的的56个共同靶点上传到String数据库进行蛋白与蛋白的相互作用分析，下载TSV格式，并导入Cytoscape3.7.2 软件进行可视化，得到PPI图（图3）。在PPI网络图中，共有56个节点，395条边，网络节点代表靶点蛋白，线条代表靶点蛋白之间的联系，节点越大、颜色越亮表示degree值越大，线条越粗表示关联程度越大。平均节点degree值为11.5，超过平均度值的靶蛋白有28个，说明这28个靶蛋白是PPI网络中的关键靶点，裸花紫珠的药理作用很可能是通过作用于这些靶点得以发挥（表2）。

表2 PPI关键靶标蛋白

图3 裸花紫珠治疗CPID的PPI网络图

2.5 GO功能富集分析

为了进一步了解裸花紫珠治疗慢性盆腔炎的靶点在生物体中发挥的作用，利用Matescape对关键靶点进行BP，MF和CC分析。GO富集分析结果显示，裸花紫珠治疗CPID的生物学过程主要包括对氧化应激的反应、对活性氧物种的细胞反应、细胞对氮化合物的反应、细胞对药物的反应等;分子功能主要包括蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶结合等；细胞组成主要包括膜筏、膜微域、蛋白质磷酸酶结合等。

2.6 KEGG信号通路富集分析

依据Pvalue以及Count进行排序，选择前10个具有代表性的通路作为重要通路并进行可视化分析（图4）。裸花紫珠治疗CPID的信号通路涉及癌症通路、炎症反应、止血、免疫等与CPID密切相关的病理生理学过程。

图4 裸花紫珠治疗CPID的KEGG富集分析气泡图

3 讨论

慢性盆腔炎的西医发病机理是病原体感染引起炎症反应，炎性浸润至盆腔器官，致组织充血、广泛粘连、瘢痕形成，局部血液循环受阻，机体组织抗氧化能力与代谢下降，因此西医治疗主要以抗生素消炎为主，疗效欠佳［13］。中医古籍中并无“慢性盆腔炎”之名，根据其临床特点，可归于“妇人腹痛”、“带下病”、“痛经”、“癓瘕”、“月经失调”、“不孕”等范畴［14］，发病部位在胞宫与冲任，但与肝、脾、肾等脏腑密不可分。其病因病机与肾气亏虚、正虚邪恋，冲任不调、气血失和，情志不畅、脏腑失调等密切相关［15］。治疗以清热祛湿、理气活血为主，扶正祛邪，标本同治，临床疗效好、副作用少。

本研究得出裸花紫珠的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、芹菜素、5-羟基-3，7，3'，4'-四甲氧基黄酮等，多属于苯丙素类、黄酮类，相关研究证明槲皮素、芹菜素能够抑制巨噬细胞COX-2的表达，减少PG的生成，达到缓解CPID疼痛、减轻炎症的作用；炎症的发生亦与NO炎症因子有关，NO能加重机体的炎症反应，芹菜素、槲皮素、木犀草素能显著抑制脂多糖（LPS）引起的巨噬细胞iNOS的过度表达，从而降低细胞内NO含量，在治疗CPID时发挥抗炎作用［16-18］。此外，芹菜素能显著增强体液免疫应答，并显著提高自然杀伤（nature killer，NK）细胞和T淋巴细胞活性，从而提高机体免疫力［19］；毛蕊花糖苷等苯丙素苷类成分可能是裸花紫珠止血作用的主要活性成分，在治疗CPID中起到止血的功效［10］。

PPI蛋白互作网络显示AKT1、TNF、ESR1、PTGS2、MMP2、PIK3R1等靶点的度值排名较前，在治疗CPID中起着重要作用，其中AKT1、TNF、PTGS2均参与免疫反应、炎症反应，且互相协调。TNF是CPID炎症反应中的重要影响因子，细菌感染后TNF迅速升高，促进炎症细胞迁移，激活或扩大炎症反应，引起盆腔周围结缔组织发生充血、水肿，逐渐演变成慢性盆腔炎［20-21］；PTGS2又称环氧化酶-2（COX-2），在炎症因子PG的合成途径中起特殊作用，与CPID炎症反应如充血、水肿、疼痛等显著相关［22］；靶点蛋白ESR1编码一种雌激素受体，该雌激素受体与雌激素结合，释放致痛物质，导致慢性盆腔痛的发生［22］。裸花紫珠的活性成分作用于AKT1、TNF、PTGS2、ESR1等

靶点，可逆转异常表达，抑制炎症因子、致痛物质的产生，从而减轻CPID的炎症反应及疼痛。

KEGG富集分析表明裸花紫珠治疗CPID的靶点主要参与PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、NF-κB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等。PI3K-Akt信号通路是细胞内最重要的生存信号之一，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节。王杰等实验证明裸花紫珠提取物可缩短小鼠的出血时间和凝血时间，其止血机制之一可能是促进血小板PI3K-Akt信号转导、刺激血小板的活化［23-24］。IL-17信号通路与炎症反应相关，该通路上的IL-17与靶细胞膜特异性受体IL17RA和IL17RC结合，通过胞内信号传导分子ACT1和TRAF6，最终激活NF-кB，启动下游炎症反应，诱导炎性细胞因子（如TNF-α等）、趋 化 因 子和基质金属蛋白酶（如MMP2、MMP9等）的表达，从而加重CPID炎症反应［25］。NF-κB是调节控制细胞凋亡、增殖、细胞应激反应、免疫和炎症反应的基因转录，相关文献表明裸花紫珠中的木犀草素等黄酮类化合物对巨噬细胞炎性反应的抑制活性可通过抑制NF-κB信号通路实现，可在不同水平抑制NF-κB信号通路，下调炎症介质的产生［18］，降低炎症递质的级联爆发，减轻炎症病理损害，松解粘连，从而发挥裸花紫珠的抗炎与免疫作用，治疗慢性盆腔炎。

4 结论

本研究基于网络药理学探讨裸花紫珠治疗慢性盆腔炎的作用机制，结果表明，裸花紫珠治疗CPID具有多成分、多靶点、多通路的特点，可能通过苯丙素类、黄酮类等活性成分作用于AKT1、TNF、PTGS2、ESR1等关键靶点，激活PI3K-Akt信号通路或抑制IL-17、NF-κB等相关通路，产生止血、抑制炎症、缓解疼痛、调节免疫等作用，从而达到治疗CPID的目的。但由于筛选条件限制只能分析得到裸花紫珠治疗CPID的主要有效成分，使得研究结果较为局限，后续需进行进一步实验验证裸花紫珠治疗CPID的潜在药理作用机制。