超高效液相色谱-串联质谱法测定马铃薯中8 种必需氨基酸

莫日根，杜艳，吕娟，王宁，朱叶青

（呼和浩特市食品检验所，呼和浩特 010090）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是仅次于小麦、稻谷和玉米的全球第四大重要的粮食作物［1］，与小麦、稻谷、玉米、高粱并称为世界五大作物。中国主要薯类作物年种植占全国可用耕地8%左右，其中，马铃薯和甘薯的种植面积和总产量均居世界第一位［2］。马铃薯含有丰富的蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、矿物质元素和维生素等营养物质。马铃薯中的蛋白质除了由非必需氨基酸构成外，也含有大量的必需氨基酸。必需氨基酸指人体不能自己合成，需要从食物中获取的氨基酸，共有8 种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。必需氨基酸摄入不足会影响机体的生理机能，造成代谢紊乱、机体抵抗力下降等［3］。世界卫生组织（WHO）把氨基酸列为人体必须的营养素之一。2015 年1 月，在北京举办的马铃薯主粮化发展战略研讨会，以马铃薯主粮化与国家粮食安全为主题，深入研讨了马铃薯主粮化的战略意义、发展思路、目标任务和推进途径，突显出马铃薯产业发展的新机遇［4］，因此针对马铃薯中的必需氨基酸进行检测分析，对于优选马铃薯品种具有重要意义。

目前，马铃薯中氨基酸的研究已有报道，赵凤敏等［5］对不同品种的马铃薯进行了氨基酸营养价值评价，并筛选出6 种氨基酸营养价值较高的品种；曾凡逵等［6］研究了马铃薯淀粉加工过程中，分离汁水回收的蛋白质氨基酸的组成，并对其进行了分析，必需氨基酸占总氨基酸的40.80%；黄闯等［7］研究了马铃薯蛋白水解液的氨基酸组成和含量，结果表明氨基酸组成比较平衡。虽然以上研究在马铃薯氨基酸分析检测方面做出一定成果，但均采用了氨基酸自动分析仪进行分析。在氨基酸分析方面，也有研究者采用柱前衍生-高效液相色谱法进行分析，如测定灵芝孢子粉［8］、新鲜烟叶［9］、野芭蕉［10］、保健食品［11］等物质中氨基酸的含量。除此之外，超高效液相色谱-串联质谱法近年来发展迅速，在医学、食品、药品等方面被广泛应用，并且作为一种优秀的分析技术被应用于测定不同物质中的氨基酸成分，如测定天南星［12］、橄榄果实［13］、植物酵素［14］、茶叶［15］等物质中氨基酸含量。相比较氨基酸自动分析和柱前衍生-高效液相色谱法，超高效液相色谱-串联质谱法具有高灵敏度、反应条件简单、节约操作时间等优点。

目前，在采用超高效液相色谱-串联质谱法测定马铃薯中氨基酸含量方面的研究仍属空白，因此笔者建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定马铃薯中缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸8 种必需氨基酸的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Ultimate 3000 型，美国赛默飞世尔科技公司。

三重四级杆质谱仪：TSQ Endura 型，配备电喷雾离子源（ESI），美国赛默飞世尔科技公司。

高速冷冻离心机：5430 R 型，德国艾本德股份公司。

超声波振荡器：FB 15065 型，美国赛默飞世尔科技公司。

涡旋混合器：Multi Reax 多通道型，德国海道尔夫公司。

圆周振荡器：MS 3 digital 型，德国艾卡公司。

电子天平：ME 204E 型，万分之一，瑞士梅特勒-托利多集团。

刀式混合研磨仪：Grindomix GM 200 型，德国莱驰公司。

均质机：T18 digital 型，德国艾卡公司。

超纯水机：Milli-Q 型，美国默克公司。

17 种氨基酸混合标准溶液：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸的质量浓度均为2.50 μmol／mL，日本和光纯药工业株式会社。

色氨酸标准品：纯度为99.9%，中国食品药品检定研究院。

甲醇：色谱纯，德国CNW 公司。

甲酸：色谱纯，天津市福晨化学试剂厂。

马铃薯样品：品种分别为福瑞特、226、黑心一号和青九，分别采自乌兰忽洞村、吉恒太村、红崖湾和新民村。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Accucore HILIC 柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm，美国Thermo Fisher 公司）；保护柱：AJO-4287 C18柱（4 mm×3 mm，美国Phenomenex 公司）；柱温：30 ℃；进样室温度：10 ℃；流动相：含0.1%（体积分数）甲酸的55%（体积分数）甲醇水溶液；等度洗脱；流量：0.20 mL／min；进样体积：2 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离（ESI）源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）模式；离子源温度：350 ℃；离子传输管温度：350 ℃；离子喷雾电压：4 500 V；鞘气流量：8.0 L／min；辅助气流量：3.0 L／min；碰撞气：氩气；8 种必需氨基酸的MRM质谱参数见表1。

表1 8 种必需氨基酸的MRM 质谱参数

1.3 溶液配制

1.3.1 色氨酸标准储备液

准确称取色氨酸标准品于50 mL 容量瓶中，加入0.1 mol／L 盐酸溶液溶解并定容至标线，上下颠倒混匀，制得质量浓度为2.50 μmol／mL 的色氨酸标准储备液。

1.3.2 氨基酸系列混合标准工作溶液

吸取17 种氨基酸混合标准溶液150 μL，再吸取1.3.1 中色氨酸标准储备液150 μL，用超纯水定容至10 mL，得到质量浓度均为37.5 μmol／L 的混合标准中间液，再根据需要，采用超纯水配制成缬氨酸、苏氨酸、亮／异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸的质量浓度均分别为0.2、0.9、1.9、2.8、3.8、4.7、5.7 μmol／L，色氨酸质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.4、1.9 μmol／L，赖氨酸质量浓度分别为0.9、2.4、3.8、5.2、6.6、8.0、9.4 μmol／L 的氨基酸系列混合标准工作溶液。

1.4 样品处理

马铃薯洗净切块，研磨并匀浆，精密称取1 g（精确至0.000 1 g）混合均匀的样品，置于50 mL 离心管中，加入25 mL 超纯水，涡旋，振荡，混合，超声提取10 min，以10 000 r／min 速率于4 ℃条件下离心10 min，吸取上清液200 μL，用水定容至10 mL，上下颠倒，摇匀，溶液过0.22 μm 微孔滤膜，注入液相色谱质谱仪，待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱

亲水作用色谱（HILIC）在针对强极性及强亲水性化合物的保留方面具有优势，可以较好地分离氨基酸等具有生物活性的极性物质。经过对多个色谱参数的优化，HILIC 色谱柱分离必需氨基酸的效果要优于C18柱，且降低了基质效应的影响，峰形得到优化，拖尾现象明显减少，因此最终选择Accucore HILIC 色谱柱。

2.1.2 流动相

甲酸和高比例水相均可提高离子化率，通过对比发现等度洗脱与梯度洗脱无明显差异，所以采用含0.1%（体积分数）甲酸的55%（体积分数）甲醇水溶液进行等度洗脱。

2.2 质谱条件优化

采用蠕动针泵，以10 μL／min 的流量，依次将1 μg／mL 单一标准品溶液与流量为200 μL／min的流动相通过三通接头混合后，直接注入质谱仪，在质荷比m／z为100～500 扫描范围内，以ESI+模式，进行一级质谱扫描，调节离子源温度、喷雾电压、离子传输管温度和气体流量等质谱参数，确定8 种必需氨基酸的母离子。结果表明，8 种必需氨基酸的母离子均为［M+H］+峰。确定母离子后，分别对其进行二级质谱扫描，选择合适的轰击能量，确定定量离子和定性离子。优化后8 种必需氨基酸的MRM质谱参数见表1。

2.3 样品前处理方法优化

2.3.1 提取溶剂的选择

在样品中分别加入0.01 mol／L 盐酸（pH=2）、60%（体积分数）乙醇溶液、含0.1%（体积分数）甲酸的25%（体积分数）甲醇溶液和超纯水，再经过1.3样品处理步骤进行提取，检测后发现超纯水的提取效率更高，因此选用超纯水为提取液。

2.3.2 称样质量的选择

分别测试了0.2 g、0.5 g 和1 g 3 种取样量，由于马铃薯中氨基酸含量较大，为避免取样量过小而导致误差增大，所以最终确定取样量为1 g，然后增大稀释倍数。

2.4 线性方程和检出限

将1.3.2 中8 种必需氨基酸的系列混合标准工作溶液按照1.2 色谱及质谱工作条件进行测定，以各物质的峰面积为纵坐标（y）、8 种必需氨基酸的质量浓度为横坐标（x），绘制标准工作曲线。当取样量为1 g 时，以信噪比分别为3 和10 时的进样浓度为方法的检出限和定量限。8 种必需氨基酸的线性范围、线性回归方程、线性相关系数、方法检出限和定量限见表2。由表2 可知，8 种必需氨基酸在各自的质量浓度范围内有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 0～0.999 6，检出限为0.04～1.50 mg／kg，定量限为0.12～4.99 mg／kg，表明该方法具有较高的灵敏度。

表2 线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 精密度与加标回收试验

按照1.3 方法对样品进行处理，在1.2 仪器工作条件下测定马铃薯样品中8 种必需氨基酸的含量，作为本底值。再精密称取已处理好的马铃薯样品18 份，分别进行3 个浓度水平的加标回收试验，在1.2 仪器工作条件下，对每个水平进行6 次平行测定，8 种必需氨基酸的精密度与加标回收试验结果见表3。由表3 可知，8 种必需氨基酸的平均加标回收率为89.9%～115.1%，测定结果的相对标准偏差为0.4%～4.6%，表明该方法具有较高的精密度和准确度，满足分析要求。

表3 8 种必需氨基酸的精密度与加标回收试验结果

2.6 实际样品测定

选取4种不同品种及产地的马铃薯，按照1.3方法进行样品处理与制备，在1.2 仪器工作条件下进行测定，马铃薯样品中8 种必需氨基酸试验结果如表4 所示。由表4 可知，不同产地的4 种马铃薯均含有丰富的必需氨基酸，其中，赖氨酸的含量高于其它几种必需氨基酸，而赖氨酸被誉为人体第一必需氨基酸，2007 年，WHO／FAO／UNU 专家委员会确定成人赖氨酸每天需要量为30 mg／kg［16］，食用马铃薯可以很好地提高赖氨酸及其它必需氨基酸的摄入量。

表4 马铃薯样品中8 种必需氨基酸试验结果 g／kg

3 结语

建立了同时测定马铃薯中8 种必需氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱法。该方法样品处理简单、灵敏度高、检测效率高，有良好的稳定性和准确度，可为其它种类的马铃薯及其食品中必需氨基酸的检测提供参考，并可为马铃薯品种育种及优选提供重要依据。