基于特征图谱及主要成分含量比例特征鉴别制草乌及其伪品

高妍，过立农，刘杰，马双成，郑健，昝珂

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

草乌是一种常用中药材，味辛、苦，具有祛风除湿、温经止痛的功效。2020 年版《中国药典》（一部）收载草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根，主要用于治疗风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛［1］。草乌主要分布于山西、河北、内蒙古和东北三省等地［2］，有大毒，含有乌头碱等双酯型生物碱等剧毒成分，需炮制后使用［3-5］。

制草乌属于草乌的加工炮制品，功效同草乌，是104 个中药成方制剂的处方药味。总生物碱为制草乌的有效成分和毒性成分。草乌经炮制后，毒性强的双酯型生物碱水解为单酯型生物碱。研究表明，虽然单酯型生物碱的毒性是双酯型生物碱毒性的1／150～1／500，但毒性依然较强，长期或超量使用会引起中毒症状，如口唇和四肢麻痹等，严重者可危及生命［6-8］。2020 年版《中国药典》中制草乌含量测定项下规定，制草乌中含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的总量应为0.020%～0.070%［1］。

在近几年开展的药材市场抽样检验工作中，发现一种制草乌伪品，该伪品经中国食品药品检定研究院鉴定为毛茛科植物准噶尔乌头Aconitum soongaricum (Regel)Stapf 干燥根的炮制品。对收集的制草乌伪品按照2020 年版《中国药典》（一部）相关规定进行测定，发现样品中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的总量结果均不符合规定，若制剂投料中混有该伪品，将造成安全隐患。

采用高效液相色谱（HPLC）法测定制草乌药材中的生物碱已有报道［9-15］，但制草乌的特征图谱以及3 种指标性成分的含量比例特征，特别是结合伪品进行分析，尚未有报道。笔者采用HPLC 法建立了制草乌和伪品的特征图谱，并对苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱3 种有效成分开展含量测定，分析并探讨制草乌及其伪品的含量特征，建立制草乌准确、快速的鉴别方法，为规范制草乌药材的使用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Agilent 1260 型，配备二极管阵列检测器，美国安捷伦科技公司。

电子天平：（1）QUINTIX313-1CN 型，感量为0.1 mg；（2）MSE125 s 型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

色谱柱： XBridge C18柱（250×4.6 mm，5 μm），填料为十八烷基硅烷键合硅胶，沃特世科技（上海）有限公司。

苯甲酰乌头原碱对照品：纯度（质量分数）为97.5%，批号为111794-201304，中国食品药品检定研究院。

苯甲酰新乌头原碱对照品：纯度（质量分数）为96.3%，批号为111795-201303，中国食品药品检定研究院。

苯甲酰次乌头原碱对照品：纯度（质量分数）为94.6%，批号为111796-201304，中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈、冰乙酸、乙酸铵和异丙醇：均为色谱纯，美国Fisher 公司。

三氯甲烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

氨水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

草乌药材样品：共收集30 批制草乌药材样品。其中20 批正品药材（编号为1#～20#），经中国食品药品检定研究院鉴定为毛茛科北乌头干燥块根的加工炮制品；10 批伪品（编号为21#～30#）鉴定为毛茛科植物准噶尔乌头根的加工炮制品。

实验用水为超纯水。

1.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品适量于10 mL 容量瓶中，以异丙醇-三氯甲烷（体积比为1∶1）混合溶液定容至标线，即得各对照品储备液。再分别取各对照品储备液适量于容量瓶中，用异丙醇-三氯甲烷（体积比为1∶1）混合溶液定容至标线，即得苯甲酰新乌头原碱质量浓度为68 μg／mL、苯甲酰乌头原碱质量浓度为16 μg／mL、苯甲酰次乌头原碱质量浓度为79 μg／mL 的对照品混合标准溶液。

1.3 供试品溶液的制备

取样品过355±13 μm 的筛（三号筛），取约2 g粉末，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加氨水3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（体积比为1∶1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率为250 W，频率为33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，于40 ℃以下减压回收溶剂至干，向残渣中精密加入异丙醇-三氯甲烷混合溶液3 mL 溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4 液相色谱条件

色 谱 柱：Waters XBridge C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，沃特世科技（上海）有限公司]；流动相：A 为乙腈-四氢呋喃（体积比为25∶15），B 为0.1 mol／L 乙酸铵水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）；梯度洗脱条件：0～48 min，15%～26%A；流量：1.0 mL／min；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：235 nm。

1.5 制草乌和伪品的特征图谱的建立

在上述条件下取得制草乌正、伪品色谱图，采用Chempattern 化学计量学软件分析采集得到的数据，对数据进行峰对齐处理，并指认特征峰。通过精密度、稳定性和重复性考察，对建立的特征图谱进行验证。进一步计算特征图谱与制草乌正品、伪品的相似度以及聚类结果，分析建立的特征图谱是否能够成功鉴别制草乌正、伪品。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱流动相选择

考察了乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸铵水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）以及2020 年版《中国药典》（一部）制草乌项下［1］采用的A 相为乙腈-四氢呋喃（体积比为25∶15），B 相为0.1 mol／L乙酸铵水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）的流动相体系下主成分的分离效果。结果发现，乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸铵水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）条件下主成分的色谱峰形不理想且分离度差，因此，最终按照2020 年版《中国药典》 （一部）制草乌项下“含量测定”的方法进行测定，也因此不再进行方法学验证。

2.2 制草乌特征图谱

分别精密称量制草乌样品（样品1#～20#），按1.3方法制备供试品溶液，分别进样测量，记录25 min的高效液相色谱图见图1 所示。采用Chempattern化学计量学软件分析采集所得数据，将样品1#设定为参照图谱，自动匹配其它样品，生成制草乌正品的特征图谱见图2 所示。对建立的特征图谱中的3 个特征峰进行指认，采用对照品比对法及DAD 光谱分析法，指认苯甲酰新乌头原碱为1 号峰，苯甲酰乌头原碱为2 号峰，苯甲酰次乌头原碱为3 号峰。

图2 制草乌HPLC 特征图谱

2.2.1 系统适用性

在1.4 色谱条件下，分别对制草乌（样品4#）、伪品（样品23#）、对照品溶液进行检测，以苯甲酰乌头原碱数据计算理论塔板数大于6 000，分离度大于1.5。对照品溶液及供试品溶液的色谱图如图3所示。

图3 制草乌、伪品与对照品的HPLC 色谱图

2.2.2 仪器精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（样品1#），在1.4色谱条件下，连续测定6 次，记录色谱图，采用Chempattern 化学计量学软件（科迈恩科技有限公司）评价，相似度为0.99。考察特征峰相对保留时间及相对峰面积，以苯甲酰乌头原碱为参照峰，结果各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差（RSD）小于1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD 小于2%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

分别于0、2、4、6、8、12、24 h，在1.4 色谱条件下测定同一的供试品（样品1#）溶液，记录色谱图。采用Chempattern 化学计量学软件进行评价，相似度为0.99。进一步考察特征峰的相对保留时间及相对峰面积，以苯甲酰乌头原碱为参照峰，发现各特征峰的相对保留时间的RSD 小于1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD 小于2%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.4 重复性试验

精密称定同一批样品（样品1#）6 份，按2.2.2方法分别制备供试品溶液并测定，记录色谱图。采用Chempattern 化学计量学软件进行评价，相似度为0.99。进一步考察特征峰的相对保留时间及相对峰面积，以苯甲酰乌头原碱为参照峰，发现各特征峰的相对保留时间的RSD 小于1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD 小于2%，表明该方法重复性好。

2.3 比较分析制草乌特征图谱与伪品色谱图

精密称定不同批次的制草乌伪品（样品21#～30#），按2.2.2 方法制备供试品溶液，测定并记录色谱图如图4 所示。采用Chempattern 化学计量学软件分析采集得到的数据，计算特征图谱与制草乌正、伪品相似度如图5 所示。结果表明，制草乌正品和特征图谱之间的相似度均大于0.90，说明相似度良好；伪品和特征图谱之间的相似度均小于0.25，可见伪品和特征图谱差异大，存在显著不同。建立的制草乌特征图谱可用于制草乌的鉴别和质量控制。

图4 10 批制草乌伪品准噶尔乌头HPLC 色谱图

图5 制草乌及其伪品相似度分析

2.4 化学计量学分析

采用Chempattern 化学计量学软件处理采集的数据（数据为AIA 格式），对相应的色谱峰进行积分，按照样品的标准化处理峰面积，聚类分析和主成分分析的结果如图6 和图7 所示。

图6 制草乌及其伪品聚类分析结果

图7 制草乌及其伪品主成分分析结果

由图6、图7 可知，两种方法均能将制草乌及其伪品分成两组，进而准确地区分制草乌的正、伪品。

建立的制草乌特征图谱，20 批制草乌色谱图与特征图谱之间的相似度均大于0.90，相似度良好，说明不同批次制草乌成分种类及含量比例相似。而10 批伪品色谱图与特征图谱之间相似度均小于0.25，相似度较低，表明伪品与正品的化学成分存在差异。采用聚类分析和主成分分析均能准确区分正、伪品，因此，基于特征图谱可以有效区分制草乌及其伪品。

2.5 制草乌3 个成分含量测定

样品按照1.4 方法制备供试品溶液，在1.5 色谱条件下进行测定，采用外标法对20 批正品和10 批伪品中3 种主成分的含量进行计算，结果分别见表1 和表2。由表1 和表2 可知，20 批正品制草乌和10 批伪品中均含有3 种单酯型生物碱，即苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱，但是制草乌和伪品中3 种成分的比例显著不同。

表1 20 批正品中3 种成分含量测定结果 %

表2 10 批伪品中3 种成分含量测定结果 %

制草乌中含量最高的是苯甲酰新乌头原碱，苯甲酰新乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值为6.80%～13.67%，平均值为10.08%；苯甲酰次乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值为0.71%～1.50%，平均值为1.00%。从含量上看，20 批正品制草乌中，有13 批的含量超过《中国药典》中0.020%～0.070%的规定，超标1.1～7.9 倍，推测为炮制不规范所致。

伪品中含量最高的是苯甲酰乌头原碱，与正品明显不同。伪品中苯甲酰新乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值为0.01%～0.06%，平均值为0.03%；苯甲酰次乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值为0.02%～0.05%，平均值为0.03%。由此可见，制草乌正、伪品中3 种主要成分的含量比例差异较大，依据主要成分的含量比例特征可以鉴别制草乌正、伪品。同时，从含量上看，10 批伪品中3 种单酯型生物碱的总量均高于《中国药典》中含量0.020%～0.070%的规定，按最高限度计算，超标4.2～26.1 倍。

实验结果表明，制草乌伪品与正品中3 种有效成分的含量比例差异较大，伪品中3 种单酯型生物碱的含量超标严重，且制草乌正伪品存在差异化学成分，若混用伪品，将直接影响制草乌的疗效和用药安全，应引起注意。

3 结语

建立了制草乌的特征图谱，同时探讨了3 种有效成分的含量比例特征，可以准确、快速地鉴别制草乌正、伪品。该方法可同时定性、定量，将为制草乌的质量控制提供科学有力的支持。