食品中沙门氏菌恒温隔绝式PCR检测方法的建立

杨若璇，佟尧，赵燕英，汤承，刘骥，朱成林，曾英杰，于基成，唐俊妮*

（1.西南民族大学食品科学与技术学院，四川成都 610041）（2.西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都 610041）（3.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041）（4.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室，沈阳大连 116600）

沙门氏菌（Salmonella）是一种革兰氏阴性的杆状细菌，属肠杆菌科，是常见的食源性病原菌。自1885年首次被分离出来，沙门氏菌血清型已发展到2637种。沙门氏菌是一种严重危害动物和人类健康的病原菌，在人类及畜禽中均曾有过沙门氏菌病爆发的记录[1]。由沙门氏菌感染而引发的病症有败血症、伤寒及肠胃炎等，婴儿、老年人及免疫力低下者还可能出现菌血症，少数还会伴随脑膜炎或骨髓炎。全球每年有1600万沙门氏菌感染病例，其中约60万死亡，据相关报道，国内外沙门氏菌污染引起食物中毒的人数频占首位[2]。近年来，许多分离菌株出现了抗生素高度耐药，给公众健康带来了巨大健康威胁[3]。因此，对沙门氏菌的检测非常重要。

对食品中沙门氏菌进行检测是预防沙门氏菌感染的有效手段。目前，沙门氏菌的检测方法主要有传统检测方法、免疫学方法、分子生物学方法以及生物传感器检测的方法等。传统检测方法依据GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》[4]的标准方法，检测步骤为预增菌、增菌、分离培养、生化实验以及血清学鉴定分型等，存在耗时长，操作繁琐等缺点[5]。近年来，学者们一直在寻找更快速的检测方法，如李倩影等[6]利用pH响应比色酶联免疫吸附法检测牛奶中猪霍乱沙门氏菌，所构建的比色ELISA方法适用于牛奶中不同浓度的猪霍乱沙门氏菌快速定量检测。Li等[7]用荧光DNAzyme和通用封堵连接剂、超聚合酶链反应形成视觉生物传感器，实现信号放大来检测沙门氏菌等。虽然这些方法快速，但也存在一定缺陷，如免疫学方法易出现假阳性或者假阴性，生物传感器在稳定性和精确度上还有待改善，并且对设备的要求非常高[8,9]。乐振窍等[10]用等温多自配引发扩增技术（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification，IMSA），建立了检测沙门氏菌的IMSA法，适合用于食品中沙门氏菌快速检测。相比较而言，分子生物学具有特异性好、灵敏度高、快速准确等优点，已经广泛应用于微生物检测中[11,12]。但是目前存在最大问题是适用于现场快速检测方法还比较匮乏。因此，针对沙门氏菌探索适用于现场快速检测的方法非常有必要。

恒温隔绝式PCR技术（Insulated isothermal PCR，iiPCR）是一种新型的分子生物学快速检测技术，基于Rayleigh-Benard的对流原理，通过反应管底部液体持续加热产生上部液体与下部液体的温度差，控制散热的速率与对流的时间，在反应管内部形成稳定温度梯度，从而提供PCR扩增所需的反应条件[13]。该技术最早在2002年，由Krishnan[14]首次报道，结合POCKITTM系列手持式核酸检测仪，体积小、自带电源，加样后一键操作，反应时间短，灵敏度高，方便快捷，可达到现场快速检测的目的。

当前国内外报道iiPCR技术的文献主要应用于虾白斑病病毒[15]、尖孢镰刀菌[16]、滑膜支原体[17]、无乳链球菌[18]、猪流行性腹泻病毒[19]、牛冠状病毒[20]等。利用该技术对食源性病原菌的研究还较少。本实验的目的是基于恒温隔绝式PCR技术建立一种快速检测沙门氏菌的方法，并应用于实际食品样品检测，为沙门氏菌现场快速检测平台建设提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

本研究所用到的沙门氏菌H9812、单增李斯特菌ATCC19115、金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌ATCC25922、蜡样芽孢杆菌ATCC11778 均由本实验室保存。

1.2 主要试剂与仪器

亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、缓冲蛋白胨水（BPW）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、1%亚碲酸钾卵黄增菌液，青岛海博生物技术有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）、TB Green Premix Ex TaqⅡ、核酸染料，GELVIEW 宝生物工程（大连）有限公司；50 bp DNA Ladder、Taq PCR Master Mix (2x，blue dye)，北京擎科新业生物技术有限公司；氯化钠，天津市致远化学试剂有限公司；G-10 电泳琼脂糖凝胶，Biowest 公司；Tris-HCl、EDTA，北京博奥拓科技有限责任公司。

POCKITTM小型智能型核酸分析仪、R-tube（48），厦门金瑞鸿捷生物科技有限公司；CFX96 荧光定量PCR 仪、VerSaDoc2000 凝胶成像系统，美国Bio-Rad有限公司；PCR 仪，TSNENEN031445 基因（美国）有限公司；Galanz WD800B 型微波炉，顺德市格兰仕微波炉电器有限责任公司；SC-15 数控超级恒温槽，宁波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf 5804R 型冷冻离心机，Eppendorf 公司；DYY-6C 电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 引物及探针的设计与合成

选取沙门氏菌的invA基因作为目标基因，利用Primer Premier 5 软件设计一对引物及探针，并对引物与探针进行BLAST 比对。另一对常规PCR 引物参考Chen 等[21]，详细引物信息见表1。引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 invA 特异性引物和探针基本信息 Table 1 invA specific primers and probes

1.4 模板DNA 的提取

本实验参考陈光丽等[22]水浴提取法提取细菌DNA。

1.5 引物及探针的验证

采用实时荧光定量PCR 仪（CFX96）对沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及大肠杆菌及阴性对照进行扩增检测，以验证引物和探针的可行性。反应体系及条件：总反应体积为20 μL：10 μL Premix Ex Taq，1.2 μL 探针(10 μmol/L)，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，1.0 μL DNA 模板，其余用无菌水补齐。反应条件：95℃变性1 min 30 s，以95℃ 5 s，55 30℃ s ，72 30℃ s 扩增40 个循环，在55℃结束开始收集荧光信号。

1.6 iiPCR 反应体系的摸索

以李凡等[20]建立的牛冠状病毒iiPCR 方法进行参考，采25 μL 体系分别对已知浓度的Taq 酶（预混酶）5 U/μL（11～13.5 μL）上下游引物10 μmol/μL（0.5～2 μL）、探针10 μmol/μL（0.25～1 μL）、模板DNA（1～4 μL）、无菌水的用量进行条件探索，确定各自用量的最佳值。

1.7 特异性试验

采用上述扩增体系，结合POCKITTM手持式核酸分析仪对上述提取的沙门氏菌和其他细菌的DNA 作为模板进行检测，判定方法的特异性。

1.8 灵敏性试验

将纯培养的沙门氏菌菌液，通过十倍梯度稀释，稀释成不同的浓度梯度（100～10-9），并同时进行平板计数，实验设置三个平行。采用POCKITTM手持式核酸分析仪进行样品的检测，确定最低检出限。

1.9 稳定性试验

参考刘健新等[23]荧光定量RT-PCR 检测方法，分别对过夜培养液的3 个稀释度（10-6、10-7、10-8）提取的模板DNA 采用POCKITTM手持式核酸分析仪进行三次重复性试验，以评价该方法的稳定性。

1.10 实际食物样品的采集

市场上采集14份食品样品，样品采集信息见表2。

表2 样品采集信息 Table 2 The sample collection information

1.11 食物样品前增菌培养时长探索

将食物样品按照每份10 g直接分装至缓冲蛋白胨水中富集培养，于培养第2 h 开始，平均每隔1 h 采集一次培养液，直至第8 h，采集前需静置5 min，利用iiPCR 和传统PCR 对上述采集点的培养液进行检测，探索实际样品最小培养时长。

传统PCR 反应体系及反应条件：Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、模板DNA1 μL、无菌超纯水补足至20 μL体系；反应扩增条件：95℃预变性5 min、95℃变性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸40 s，35 个循环；72℃延伸10 min。产物于4℃保存或进行凝胶电泳检测。

产物的琼脂糖电泳检测：配置的琼脂糖凝胶的浓度为3%，取4.5 μL 扩增产物进行点样，90 V、72 A条件下电泳40 min，在凝胶成像系统下观察结果。

1.12 实际采集食物样品检测

针对市场上采集的14 份食品样品，采用传统PCR方法、iiPCR 方法对样品进行检测，比较其检出率，同时采用传统培养法对结果进行验证。并将建立的iiPCR 方法，与国标法、传统PCR 方法和荧光定量PCR从样品采集到结果检出整个流程制作流程对比图。

1.13 数据处理

数据采用Microsoft Excel、SPSS 25 软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 引物及探针验证结果

成功建立iiPCR 检测方法的前提是选择合适的靶基因和探针设计[24]，因此，本实验的引物和探针设计至关重要。肠侵袭蛋白与沙门氏菌的侵袭能力紧密相关[25]，其中invA是主要的毒力因子，可以作为沙门菌属的特异性基因[26]。因此，本实验选择invA基因作为研究的靶基因。通过本实验设计引物和探针，采用传统PCR 和实时荧光定量PCR，分别对沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及大肠杆菌进行扩增，结果见图1，从图中可以看出只有沙门氏菌能够出现特异性扩增，其他4 株菌未见任何扩增，证明设计的沙门氏菌引物与探针具有良好的特异性。

图1 沙门氏菌的引物、探针验证结果 Fig.1 The primer and probe verification for Salmonella

2.2 反应体系优化探索结果

通过对上、下游引物区间范围用量、探针区间范围用量、模板区间范围用量进行优化筛选，摸索出沙门氏菌iiPCR 最终反应体系为：5 U/μL Taq 酶（预混酶）12.5 μL，10 μmol/μL 上、下游引物各1 μL，10 μmol/μL 探针0.5 μL，模板2 μL，补足无菌水至25 μL。

2.3 特异性试验结果

进一步将沙门氏菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的DNA 按上述程序进行iiPCR 扩增，结果见图2，图中POCKITTM手持式核酸分析仪界面上显示只有沙门氏菌检出为阳性(+)，单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和阴性对照均检出为阴性(-)，初步表明针对沙门氏菌建立的iiPCR 检测方法特异性良好。

图2 沙门氏菌特异性试验 Fig.2 Specific test for Salmonella

2.4 灵敏度和稳定性试验结果

将纯培养浓度为7.5×108CFU/mL 沙门氏菌菌液，通过梯度稀释至不同的浓度，然后采用上述扩增体系对不同稀释浓度的培养液（7.5×102CFU/mL、7.5×101CFU/mL、7.5 CFU/mL）进行检测，从图3 中可以看出，POCKITTM手持式核酸分析仪界面上3 号孔显示为阴性(-)，1 号孔和2 号孔显示为阳性(+)，三次重复实验的结果一致，表明所建立的iiPCR 方法稳定性良好，对沙门氏菌纯培养液的最低检出限为75 CFU/mL。

图3 沙门氏菌稳定性和灵敏度试验 Fig.3 The stability and sensitivity test evaluation for Salmonella

进一步将纯培养浓度为7.5×108CFU/mL 的沙门氏菌菌液通过十倍梯度稀释培养液，分别采用传统PCR 方法及实时荧光定量PCR 方法进行灵敏度检测对比，结果见图4a 和4b。由图4a 可得，传统PCR方法对沙门氏菌的最低检出限为泳道6 中的7.5×103CFU/mL；由图4b 可得，实时荧光定量PCR 方法对沙门氏菌的最低检出限为7.5×102CFU/mL；而本研究建立的iiPCR 方法对沙门氏菌的最低检出限为75 CFU/mL，灵敏度比传统PCR 灵敏100 倍，比实时荧光定量PCR 灵敏10 倍。

图4 沙门氏菌的传统PCR 和实时荧光定量PCR 敏感性试验 Fig.4 Sensitivity test by traditional PCR and real-time fluorescence quantitative PCR for Salmonella

2.4 食物样品前增菌培养时长的探索结果

对实际采集的阳性样品在缓冲蛋白胨水（BPW）中进行预增菌，通过对2、3、4、5、6、7 和8 h 时的培养液进行检测，结果见图5。由图5a 可以看出，采用传统PCR 检测，在8 h 预增菌的培养点上可以检测出阳性条带。由图5b 可以看出，iiPCR 在5 h、6 h、7 h 和8 h 的预增菌培养点上都可以检测出阳性结果，说明建立的iiPCR 方法检测的灵敏度更高。

图5 实际样品前增菌培养时间探索 Fig.5 Exploring the pre-enrichment and cultivation time for actual samples detection

2.5 方法的初步应用

采用建立的iiPCR方法对采集的14份实际样品进行检测，在5 h 增菌培养点，iiPCR 方法扩增结果见图6，iiPCR 方法对2 份样品检出沙门氏菌呈阳性结果，检出率为14%（2/14）。

图6 食品样品iiPCR 在5 h 培养点的检出结果 Fig.6 The iiPCR detection results for food samples at 5 h

2.6 三种检出方法的比较及检测流程对比

采用建立的iiPCR方法与传统PCR方法以及传统培养分离法对采集样品进行检出结果比较，结果统计见表3。在8 h 培养点时传统PCR 方法扩增结果见图7，传统PCR 方法也可对2 份样品（11 号和12 号）检出沙门氏菌阳性结果，检出率为14%（2/14）。根据GB 4789.4-2016 对18 h 培养点的样品进行分离鉴定，结果见图8a，发现所检出的2 份阳性样品分离的菌落，可在BS 培养基上生长为圆形、呈黑色并带有金属光泽的菌落，在传统培养法分离的菌落进行常规PCR 鉴定，检测结果见图8b，图中也显示只有11 号和12 号检测结果呈阳性，其余均为阴性，与5 h 培养点时的iiPCR 方法检测出阳性结果一致。

表3 三种检测方法的比较 Table 3 The comparison of three detection methods

图7 食品样品经过8 h 预增菌的PCR 检出结果（沙门氏菌）Fig.7 Food sample detection results of traditional PCR by 8 h pre-enrichment culture (Salmonella)

图8 传统培养法分离的菌落（a）和分离细菌的PCR 鉴定结果（b）Fig.8 The traditional culture method validation (a) and PCR identification results (b)

对建立的iiPCR 方法和传统培养法、传统PCR 方法、荧光定量PCR 进行对比，从样品的采集到结果的检出，传统培养法整个鉴定检测流程至少需要4～6 d[27]，传统PCR 方法检测整个流程需12～16 h 甚至更久，荧光定量PCR 方法检测整个流程需10～12 h 左右，而iiPCR 方法检测整个流程可在6～8 h 完成，比其他检测方法节省很多时间，并且可直接得出结果，操作更便捷，如图9。

图9 iiPCR 方法和其他检测方法对比流程图 Fig.9 The comparison flow chart of iiPCR and other detection methods

细菌在接种培养后，前1～4 h 生长一般迟缓，繁殖数量较少，迟缓期后，进入对数期，这个时期细菌开始大量繁殖。本研究通过探索对于食品样品中沙门氏菌前增菌培养时间，只需在缓冲蛋白胨水中培养5 h后配合水浴法提取模板DNA，利用建立的iiPCR 方法即可检测出样品中是否含有沙门氏菌。研究结果和Tsen 等[28]及Du 等[29]探索结果相似，Tsen 等[28]针对鸡肉中沙门氏菌检测，验证鸡肉样品经过富集以及DNA提取步骤，可利用iiPCR 在8 h 内完成检测结果。Du等[29]针对餐饮中的沙门氏菌和志贺氏菌进行iiPCR 方法的开发和评估，说明该技术对食品污染致病菌的检测应用是可行的。本实验建立的iiPCR 方法灵敏度比Du 等建立的iiPCR（最低检出限103CFU/mL）灵敏度高，本实验检出限为75 CFU/mL。结合POCKITTM系列手持式核酸检测仪42 min 的反应和结果显示，大大节省时间，从目标细菌富集，细菌模板DNA 提取，靶特异性基因扩增，到检测结果显示，整个检测流程可在6～8 h 左右完成。

3 结论

3.1 本研究建立了检测沙门氏菌的iiPCR 方法，克服了仪器昂贵、不方便携带、操作人员要求高等缺点。选择沙门氏菌invA 基因作为本方法的靶基因，设计了引物和探针，对iiPCR 反应体系进行优化，获得最佳反应体系。经实验得出建立的iiPCR 方法灵敏度高，沙门氏菌的最低检出限可达75 CFU/mL，采用iiPCR检测其他细菌（单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌等）结果无交叉反应，说明特异性良好。并分别对沙门氏菌培养液的三个稀释度进行了三次重复实验，结果完全一致，说明建立的iiPCR 方法稳定性良好。

3.2 利用上述建立的方法对实际采集食品样品进行应用检测，将采集的14 份食品样品直接在缓冲蛋白胨水中富集培养，采集2、3、4、5、6、7、8 h 的培养液，同时采用建立的iiPCR 方法和传统PCR 方法进行样品检测和比对，结果表明在5 h 的培养点，建立的iiPCR 方法能对2 份样品可检测出沙门氏菌阳性结果，检测率为14%（2/14）；而采用传统PCR 方法在8 h培养点时才能对这2 份样品检测出阳性结果，检出率为14%（2/14）。虽然实时荧光定量PCR 灵敏度要高于传统PCR 2～3 个数量级，但本研究建立的iiPCR 方法比实时荧光定量PCR 的灵敏度高10 倍，且基于4通道POCKITTM 手持核酸分析仪，自带电源，体型小，方便携带并且一键操作，加样后直接反应，检测过程仅42 min，反应后结果直接显示于液晶屏，省去分析及凝胶电泳等繁琐过程，整体耗时要远比传统PCR 和荧光定量PCR 检测方法少。可见，针对实际样品的检测，建立的iiPCR 更加快捷、灵敏和实用。但本研究也存在不足，特别是方法中涉及的阳性菌株和阴性菌株数量不够多，为更好地评价建立的iiPCR方法的特异性和灵敏度，我们会在后续的研究中进一步增加食品样品采集数量，并与传统法和荧光实时定量PCR 方法进行比较，以达到方法的推广使用。

3.3 综上，本研究建立的一种基于恒温隔绝式PCR技术检测沙门氏菌的方法，对方法进行部分应用，初步证明该方法灵敏度高，特异性好，稳定性好。将该方法结合水浴法快速提取模板DNA 以及POCKIT™手持式核酸分析仪，通过设计特异性引物和探针，可实现对沙门氏菌现场快速检测。从目标细菌富集，到模板DNA 提取，特异性基因扩增到出现检测结果，整个过程可在6～8 h 完成。相比其它检测方法，至少节省6 h 检测时间，省去凝胶电泳过程，操作更便捷。