草菇培养料发酵过程中细菌菌群的变化研究

蒋 宁，李辉平，林金盛，侯立娟，曲绍轩，骆 昕，马 林*

(1.江苏省农业科学院 蔬菜研究所，南京 210014；2.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014)

草菇(Volvariellavolvacea)又名中国蘑菇，隶属于担子菌纲(Basidiomycetes)伞菌目(Agaricales)小苞脚菇属(Volvariella)[1].草菇是生长于热带、亚热带的一种高温型食用真菌，营养丰富，深受消费者喜爱.草菇多糖、蛋白等活性成分具有降低胆固醇、提高免疫、抗肿瘤、降血糖、抗癌等功能[2-3].我国是草菇最大生产国，产量居世界之首[4]，根据中国食用菌协会数据显示，2019年中国草菇产量为23.43万t.

培养料的隧道发酵技术已经在双孢蘑菇栽培中得到广泛应用[5]，草菇栽培技术与双孢菇极为相近，利用隧道发酵技术对草菇培养料进行处理从而实现工厂化栽培的研究目前正处于研究阶段，但与双孢蘑菇相比，草菇生长对环境条件更加敏感，对培养料的要求更高，还不能完全应用双孢蘑菇的发酵技术，需在现有技术的基础上进一步研究，从而有效提高草菇产量、降低生产成本、促进草菇工厂化栽培[6].

草菇培养料中存在大量的微生物[7]，经过一次、二次隧道发酵及播种草菇菌种后，培养料中的微生物菌群都会出现更替[8].双孢菇栽培中随着培养料发酵的进行，微生物的数量均表现为先下降后上升的趋势，其中细菌占据优势[9]，但工厂化草菇生产模式下的细菌菌群研究还未见报道.因此本研究将采用Illumina Hiseq高通量测序技术分析以食用菌菌渣为主的培养料中细菌菌群结构变化，并结合培养料的碳氮比和产量表现，为合理利用食用菌菌渣进行工厂化生产草菇提供理论依据.

1 材料与方法

1.1试验材料

草菇菌种：V28，江苏省农业科学院蔬菜研究所提供.

培养料配方：① 配方A：鹿茸菇菌渣5%，杏鲍菇菌渣90%，稻草5%；② 配方B：鹿茸菇菌渣74%，杏鲍菇菌渣25%，稻草1%.

1.2 试验方法

1.2.1 取样 分别收集一次、二次隧道发酵结束后的培养料及出菇前的培养料(编号：1、2、3)，采用随机取样法，每个批次取5个点，三次重复，每重复分两份样品.一份用于碳氮比测定，另一份用于细菌多样性检测.

1.2.2 培养料碳氮比测定 培养料烘干后各取0.2 g，采用硫酸-双氧水消解，凯氏法测定培养料全氮含量[10]；培养料烘干后各取0.03 g，采用重铬酸钾氧化-外加热法测定培养料全碳含量[11].计算各时期样品的碳氮比.

1.2.3 细菌多样性检测 建库测序：利用DNA提取试剂盒提取培养料中细菌DNA，用通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[12]进行细菌16S rRNA基因V3～V4可变区片段PCR扩增.PCR产物送百迈客生物科技有限公司利用Illumina Hiseq平台构建小片段文库并进行高通量测序[13].生物信息学分析：测序得到的原始数据经过Trimmomatic v0.33软件过滤后，使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量Reads；使用 FLASH v1.2.7软件拼接Reads得到Clean Reads；利用UCHIME v4.2软件[14]鉴定并去除嵌合体序列，得到有效数据；使用Usearch软件[15]对序列在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得分类操作单元OTU，并分别在门、纲、目、科、属等分类水平分析菌群结构.采用QIIME2软件[16]进行微生态学生物信息分析，包括菌群结构、α多样性、β多样性等多种分析.

1.2.4 草菇产量记录 二次发酵结束的培养料经播种后进行常规的工厂化出菇管理，分别记录两个配方两潮草菇采收后商品菇的总产量.

2 结果与分析

2.1 碳氮比测定

通过在不同时期测定培养料中的碳氮比，结果如表1所示.2个配方的变化规律有差异.在全碳含量上，以杏鲍菇菌渣为主的配方A在一次发酵后的全碳含量最高，后续含量降低；以鹿茸菇菌渣为主的配方B则在一次发酵后的全碳含量最低，后续含量增加；呈现出了相反的变化规律.在全氮含量上，两个配方的变化规律相近，均是一次发酵后的全氮含量最低，且与二次发酵后的全氮含量差异显著(P<0.05).在碳氮比结果中，配方A变化规律为逐渐升高，而配方B表现为先降后升的规律.

表1 培养料碳氮比测定结果Tab.1 The C/N ratio of compost

2.2 细菌多样性分析

2.2.1 α多样性分析 配方A和B在3个时期培养料共有725个OTU，各阶段OTU数量如表2所示，数量最多和最少的阶段分别出现在配方B的一次发酵结束后(652)和出菇前(501).α多样性分析指数可体现样品中细菌群落的多样性(Simpson和Shannon)和丰富度(Chao和Ace).配方A在4个指数的变化上规律一致，均为先升高再降低；配方B在一次发酵结束后培养料中的细菌群落不论是在多样性还是丰富度上都处于最高值，且差异性显著(P<0.05)，而细菌群落的多样性和丰富度最低点分别为配方B的二次发酵结束后和出菇前，但差异不显著(P<0.05).

表2 培养料中细菌α多样性分析Tab.2 α-diversity analysis of bacteria at different composting stages

2.2.2 Venn图分析 在2个配方3个时期培养料内检测到的725个OTU中，有329个OTU存在于所有样品中，在A2、A3、B2、B3中未检测到单个样品特有OTU，在A1和B1中分别有4个和14个OTU,如图1所示.从不同配方来看，在配方A中，有442个共有OTU，一次发酵结束后有39个特有OTU；在配方B中，有403个共有OTU，一次发酵结束后有83个特有OTU，随后特有OTU数量明显下降，至出菇前仅有4个特有OTU.

图1 OTU Venn图Fig.1 Venn chart of OTU of different samples

2.2.3 细菌群落分析 培养料中的细菌群落种类如图2所示，在门水平上，主要的细菌菌群包括厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门等.一次发酵结束后，变形菌门和厚壁菌门的相对丰富度高达80%以上，其次为拟杆菌门；二次发酵结束后，厚壁菌门的相对丰富度增加，而变形菌门则大幅度降低，在配方B中放线菌门的相对丰富度明显增加，且高于配方A；在出菇前期，厚壁菌门依然为优势菌群，放线菌门在不同配方中表现出截然相反的变化.

图2 培养料中门、属水平细菌群落结构分布图Fig.2 Bacterial community structure and distribution of compost at the phylum and genus level

在属水平上，一次发酵结束后样品中的细菌群落与二次发酵结束和出菇前样品中的在细菌群落种类上变化较大，相对丰富度较高的包括变形菌门的不动杆菌、丛毛单胞菌属、寡养单胞菌、肠杆菌属和厚壁菌门的巨球形菌属、乳杆菌属以及配方A中拟杆菌门的普雷沃菌属.二次发酵结束后和出菇前的菌落类别变化较小，主要包括厚壁菌门的Limnochordaceae、热芽胞杆菌属、共生小杆菌属、瘤胃梭菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌，放线菌门的双孢菌属、小单孢菌、热多孢菌属变形菌门的流行杆菌属；但在菌群相对丰富度的变化上，配方A和B出现了截然不同的结果，即配方A中Limnochordaceae、热芽胞杆菌属、热多孢菌属、流行杆菌属菌群相对丰富度由低变高，配方B中则由高变低，配方A中共生小杆菌属、瘤胃梭菌属、棒状杆菌等菌群相对丰富度逐渐降低，配方B中则逐渐增加.

从菌群变化结果上可以看出，二次发酵对培养料中菌群变化起了关键性作用，且培养料配方不同，所含菌群的种类及数量都有明显差异.

2.2.4 β多样性分析 图3中每个点代表一个样本，一次发酵结束后的样本全部与后续样本距离较远，所示结果与2.2.3一致，说明二次发酵前后培养料中细菌群落结构差异较大；二次发酵之后的两次取样结果距离近，说明二次发酵之后的细菌群落结构相似度高，差异小，尤其在配方A中差异更小.

图3 培养料中细菌β多样性分析Fig.3 β-diversity analysis of bacteria at different composting stages

2.3 草菇产量统计

配方A和B采收两潮后记录草菇总产量如表3所示，以杏鲍菇菌渣为主的配方A产量明显高于以鹿茸菇菌渣为主的配方B，分别为3.24 kg/m2和2.96 kg/m2，但差异不显著(P<0.05).

表3 不同配方草菇产量统计Tab.3 The straw mushroom yield of different formula

3 讨论与结论

近年来，我国食用菌产业发展迅猛，已成为世界上食用菌生产大国之一.据中国食用菌协会统计，2019年全国食用菌生产总量达3 933.87万t，产值3 126.67亿元，按照食用菌生物学平均效率40%，即每生产1 kg食用菌产生0.4 kg菌渣来计算，约产生菌渣1 573.55万t[17].尤其是工厂化栽培之后的菌渣仍含有较多的有机碳、粗纤维、粗脂肪、木质素等，此外还含有丰富的粗蛋白，可进行循环再利用[18].杏鲍菇产量占江苏省食用菌总产量的50%以上，而鹿茸菇则是近两年来发展迅速的工厂化栽培新品种.因此本研究中草菇的培养料配方分别以杏鲍菇和鹿茸菇菌渣为主进行配置，从产量统计结果可以看出，虽然杏鲍菇菌渣栽培草菇产量高于鹿茸菇菌渣，但差异不显著，两种菌渣均可进行二次利用栽培草菇.

C/N是培养料发酵过程中一个关键因素，C/N过高会抑制细菌和其他微生物的生长，分解有机物速度放慢、发酵时间拉长[19].从两种配方栽培过程中碳氮比变化过程看，以杏鲍菇菌渣为主的配方碳氮比变化趋势为逐渐下降，说明发酵阶段微生物的大量繁殖有效促进了有机物的降解，与刘顺杰等[20]用废棉培养料栽培草菇和高晓静等[21]栽培双孢蘑菇时的碳氮比变化规律一致.但以鹿茸菇菌渣为主的配方碳氮比变化趋势则有所差异，表现为先降后增.这说明发酵阶段有效促进了有机物的降解.

通过对16S rRNA的片段进行扩增测序，能够了解生境中微生物的种类及数量比例，并将其分类到属，基于这些微生物群落结构信息，能够研究微生物之间以及微生物与生境的关系[22].通过草菇培养料不同时期细菌菌群分析，发现草菇培养料中具有丰富的细菌群落，其中相对丰富度最高的菌落在门分类上与废棉为基质的草菇发酵料中相似[20].在发酵的不同阶段，发酵温度和培养料的理化性状不断地发生变化，培养料中的细菌群落结构也在发生变化.不同菌渣配方培养料中细菌菌群相对丰富度有所变化，但种类变化较少；但二次发酵前后各配方的细菌菌群种类都发生了较大变化，与双孢蘑菇二次发酵前后的细菌菌群变化相似[23].有些细菌中可能存在某些特殊物质(微生物菌体或代谢产物)，这些物质可能是草菇生长发育必需的营养物质或是激素物质，对草菇生长有好处[24].在发酵期和出菇期厚壁菌的量均较多，尤其是芽孢杆菌类细菌在大量报道中被认为是高温发酵中非常重要的一类耐热细菌[8]，可以抵抗脱水和极端环境；发酵成熟的培养料中含有的大量放线菌[25]，通过自身代谢作用，使培养料木质素内部结构发生变化，并最终分解转化木质素、形成腐殖质[26].但二次发酵后不同配方培养料中细菌菌群的差异性变化是否会影响草菇产量，还需要进一步研究.