长链非编码RNA HOXA11-AS在乙肝继发小肝癌中的表达意义

秦建增 杜世奇 张玉华

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染为临床上比较常见的传染性疾病，其引起的肝硬化能够造成肝细胞的再生与肝脏的持续性炎症，大约75%的小肝癌患者发病前伴随有肝硬化。不过从乙肝继发到小肝癌的周期比较长，也涉及到细胞增殖、凋亡、侵袭和转移相关的基因的异常表达[1-2]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度介于200到10万个核苷酸之间的没有编码功能的RNA，在早期被认为是DNA转录异常的产物[3]。随着研究技术的深入，已有研究显示lncRNA在癌组织中呈现差异性表达，其可通过吸附或调控小RNA(miRNA)来参与基因和蛋白的调控，从而可作为恶性肿瘤的诊断标志物[4]。同源异形盒基因A11反义RNA(HOMEOBOX A11 antisense RNA，HOXA11-AS)是1种与恶性肿瘤细胞周期相关的lncRNA，能反映肿瘤的分级与预测预后[5-6]，本文具体探讨了lncRNA HOXA11-AS在乙肝继发小肝癌中的表达意义，希望为临床上进一步探索影响小肝癌发生的分子机制提供参考。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2017年2月到2020年5月选择在本院接受诊治的乙肝肝硬化患者268例，其中200例为单纯乙肝肝硬化患者(肝硬化组)，68例为乙肝继发小肝癌患者(小肝癌组)。纳入标准：血清乙肝表面抗原(HBsAg)阳性；本院伦理委员会批准了此次研究；患者签署了知情同意书；年龄20～75岁；都符合单纯乙肝肝硬化或乙肝继发小肝癌的诊断标准。排除标准：入院前3个月有护肝药物使用史的患者；转移性肝癌患者；合并有胆汁淤积性肝病、酒精性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性肝病等患者；精神系统疾病患者；既往有任何放疗、化疗等患者。

1.2 lncRNA HOXA11-AS表达检测

采用EDTA 抗凝血型管采集所有患者的血液标本2～3 ml，24 h内采用淋巴细胞分离液进行混合，3 000 rpm/min离心20 min，取血细胞。使用Tizol试剂提取总RNA，逆转录条件设定为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 8 min。对逆转录形成的cDNA浓度进行测定，对其进行稀释溶解后用于PCR测定。PCR引物根据lncRNA HOXA11-AS在NCBI中的序列通过NCBI primer进行分析，PCR反应条件：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次，以U2作为内标，计算lncRNA HOXA11-AS相对表达水平。

1.3 调查资料

调查2组患者的性别、年龄、体重指数、AFP、ALT、AST值等指标，记录小肝癌组患者的肿瘤最大直径、临床分期、远端转移、肿瘤包膜、组织学分化等指标。

1.4 统计方法

本研究采用SPSS19.00统计软件对数据进行统计学分析，采用均数±标准差表示计量数据(对比为t检验)，采用%、率等表示计数数据(对比为卡方χ2分析)，采用单因素和Cox多因素分析数据资料，P<0.05时差异在统计学上具有意义。

2 结果

2.1 一般资料对比

2组的性别、年龄、体重指数、AFP、ALT、AST值对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料对比

2.2 lncRNA HOXA11-AS相对表达水平对比

小肝癌组的lncRNA HOXA11-AS相对表达水平(21.48±1.38)显著高于肝硬化组(2.09±0.14)(t=78.922，P<0.001)。

2.3 不同病理特征与lncRNA HOXA11-AS表达水平的相关性

在小肝癌组中，lncRNA HOXA11-AS相对表达水平与肿瘤最大直径、临床分期、远端转移、肿瘤包膜、组织学分化存在相关性(P<0.05)。见表2。

表2 乙肝继发小肝癌患者的不同病理特征与lncRNA HOXA11-AS表达水平的相关性

2.4 影响因素分析

在小肝癌组中，以lncRNA HOXA11-AS相对表达水平作为因变量，以肿瘤最大直径、临床分期、远端转移、肿瘤包膜、组织学分化作为自变量，单因素和Cox多因素分析显示临床分期、远端转移、组织学分化、肿瘤包膜为影响lncRNA HOXA11-AS相对表达水平的主要因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响乙肝继发小肝癌患者lncRNA HOXA11-AS相对表达水平的单因素与多因素分析(n=68)

3 讨论

小肝癌具有发病率高、预后差、容易转移复发等特点，但小肝癌多由乙肝肝硬化发展而来，也是多步骤、多阶段的过程，其开始于肝组织受到乙肝病毒感染导致的肝硬化过程，为此早期筛查与诊断具有重要价值[7]。近年来，为了提高小肝癌的早期诊断率，已有AFP、ALT、AST等血清标志物应用于肝癌的诊断，但是诊断敏感度或特异度均不够理想。本研究也显示2组的性别、年龄、体重指数、AFP、ALT、AST值对比差异无统计学意义(P>0.05)，为此需要继续在临床上寻找与小肝癌诊断或预后评估有关的肿瘤标志物。

lncRNA在人体机制中的调控作用已经逐渐得到学术界认可和重视，lncRNA分子在许多肿瘤疾病中都参与发挥着调控作用。lncRNA在体液中的存在形式比较稳定，可以持续地被检测到，对肿瘤细胞内的变化反应也较为灵敏。它可以通过与各蛋白分子及蛋白复合物相结合，对相邻蛋白的编码基因表达造成影响，发挥染色质结构的修饰、转录和调节作用。已有不少研究证明了lncRNA在乳腺癌、肺细胞癌、胃癌患者体内有异常表达情况，可以作为其病理诊断的临床独立预测因素[8-9]。同源盒(homeobox，HOX)家族基因与胚胎发育和肿瘤发生存在相关性，其也为一种高度保守的同源异形结构域。HOX包括A、B、C、D 4个簇，其中HOXA基因簇5’区域的方向涉及到正义链中编码蛋白质的基因，lncRNA HOXA11-AS作为其中一种新的长链非编码RNA，位于染色体7p15.2上，在神经胶质瘤、浆液性卵巢癌、上皮性卵巢癌、宫颈癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌、结直肠癌等发挥着促癌或抑癌等作用[10-11]。本研究显示小肝癌组的lncRNA HOXA11-AS相对表达水平高于肝硬化组(P<0.05)，表明乙肝继发小肝癌患者多伴随有lncRNA HOXA11-AS的高表达，lncRNA HOXA11-AS也在小肝癌中发挥着促癌作用。

随着医学技术的发展，多种肝癌相关的IncRNA已被鉴定，IncRNA可通过各种不同机制影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡等过程。有研究通过对PC3细胞和LNCaP细胞进行lncRNA的过表达质粒后进行增殖活性检测，发现LNCaP细胞在过表达lncRNA之后，细胞增殖能力显著增强，当对lncRNA表达进行敲减之后，细胞增殖能力也显著降低[12]。有学者对肝癌细胞进行Transwell小室模拟实验，发现肝癌细胞的迁移侵袭能力在lncRNA分子敲减之后显著降低，证明lncRNA的表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力相关[13]。有研究通过建立裸鼠模型进行试验，发现过表达lncRNA的裸鼠体内肝脏发生多发转移，证明lncRNA在肝癌细胞的恶性进展中的推动作用[14-15]。本研究显示小肝癌患者的lncRNA HOXA11-AS相对表达水平与肿瘤最大直径、临床分期、远端转移、肿瘤包膜、组织学分化存在相关性(P<0.05);单因素和Cox多因素分析显示临床分期、远端转移、组织学分化、肿瘤包膜为影响lncRNA HOXA11-AS相对表达水平的主要因素(P<0.05)，说明小肝癌患者的病理特征与lncRNA HOXA11-AS表达水平存在相关性。

当前也有研究表明lncRNA HOXA11-AS为胃癌患者中表达显著上调，敲低lncRNA HOXA11-AS可抑制胃癌细胞的增殖、迁徙、侵袭能力，促进细胞凋亡、阻滞细胞周期[16]。lncRNA HOXA11-AS可通过富集miR-140—5p途径调节胶质瘤的发生，lncRNA HOXA11-AS表达水平较高的患者预后较差[17]。不过lncRNA的生物学功能在肿瘤的病程变化的同时也会发生变化，因此需要对其进行更进一步的研究，避免在治疗中发生不可预料的副作用，逐渐挖掘其临床治疗价值。

总之，lncRNA HOXA11-AS在乙肝继发小肝癌患者中呈现高表达情况，临床分期、远端转移、组织学分化、肿瘤包膜与lncRNA HOXA11-AS表达存在相关性，也是影响lncRNA HOXA11-AS的主要因素。