miR-300通过下调ROCK1降低肝癌细胞增殖和分化的研究

贡旭楠 饶艳伟

肝癌是一种最常见的恶性肿瘤，在癌症的死亡率中排在第二位。肝癌的诱因包括遗传因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪肝、吸烟和长期酗酒等，而且会持续影响肝癌的转归，但其分子作用机制至今还不清楚。临床治疗肝癌的主要方法包括：手术治疗、化疗和肝移植等，治疗后存在生存率低和转移的情况。mi RNAs是一种没有编码的RNA，长度约为22个核苷酸组成，可以直接靶向3’-UTR mRNA，引起mRNA的降解和抑制翻译过程，在细胞中扮演着调控基因表达的作用。研究证明miRNAs是癌症发生、发展的主要调控基因，功能为致癌基因或抑癌基因，调控细胞的分化、侵袭和转移。有研究显示在肝癌中存在很多的miRNAs功能紊乱，其可能参与肝癌的发生、发展的过程。研究显示miR-300在肝癌组织和细胞中存在高表达，但是也有研究表明其低表达[1-4]。现阶段针对miR-300在肝癌中的分子作用机制还不明确，影响的下游目的基因还不清楚。因此，本研究针对miR-300对肝癌的分化、转移的分子机制做进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂

miR-300 mimic(The sequences of miR-300 were as follows：Sense，5'-UAU ACA AGG GCA GAC UCU CUC U-3'；anti-sense，5'-AGA GAG AGU CUG CCC UUG UAU A-3'.)；miR-300 引物：5'-TAT ACA AGG GCA GAC TCT CTC T-3'(Forward)，U6：5'-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CGT-3'(Reverse)；ROCK1引物：5’-AGGA AGGCGGACATATTAGTCCCT-3’(Forward)，5’-AGAC GATAGTTGGGTCCCGGC-3’ (Reverse)；GAPDH 引物：5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3'(Forward)，5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3'(Reverse)；pcDNA3.1 Vector订购于美国Thermo Fisher Scientific，Inc.；ROCK1蛋白抗体订购于Abcam。

1.2 细胞培养

肝癌细胞HepG2、Huh-7和人正常肝细胞HL-7702细胞为吉林省人民医院中心实验室赠予。HepG2和Huh-7细胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养，并保持一定的湿度。所有细胞均采用0.4%胰酶消化传代培养。

1.3 RT-qPCR检测肝癌组织和细胞中的miR-300和ROCK1的表达水平

根据TRIzol试剂盒(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)提取组织和细胞中总RNA，依照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 试剂盒(Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.) 在如下条件16 °C，30 min；42 °C，30 min；85 °C，5 min。cDNA合成通过Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase 试剂盒(Takara Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China) 条件：37 °C，15 min；72 °C，10 min，qPCR 扩增采用Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.)条件：95 °C，10 min；40 个循环：95 °C 15 s和 60 °C，60 s。

1.4 Western Blot检测HepG2和Huh-7细胞中ROCK1蛋白表达

提取细胞总蛋白，Bio-Rad法测定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤操作，测定样品的蛋白浓度。用Image J图像处理软件计算各条豆类灰度值，分析ROCK1蛋白表达情况。目的蛋白与内参照β-肌动蛋白(β-actin)的灰度值的比值进行描述表达情况。

1.5 MTT检测HepG2和Huh-7细胞增殖率

按使用说明书用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法检测细胞生存能力。全自动酶标仪(波长570 nm)测定各孔OD值，计算细胞生存率。

1.6 流式细胞术检测Sub-G0/G1值

肝癌HepG2和Huh-7细胞在转染miR-300 mimic后，收集细胞，加入70%的乙醇，通过碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通过Aria Ⅱ sorter流式细胞仪分析(BD Biosciences)，每组计数10000个细胞，统计出Sub-G0/G1值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 RT-qPCR检测肝癌组织和细胞中miR-300和ROCK1的表达水平

与正常组织相比，肝癌组织中miR-300的表达水平明显降低(P<0.001)，如图1A，ROCK1的表达水平明显增加(P<0.001)如图1C。与人正常肝细胞HL-7702相比，肝癌细胞HepG2和Huh-7中miR-300的表达水平明显降低(P<0.001)，如图1B，ROCK1的表达水平明显增加(P<0.001)如图1D。

图1 RT-qPCR检测肝癌组织和细胞中miR-300和ROCK1的表达

2.2 转染miR-300 mimic后，HepG2和Huh-7细胞中ROCK1的表达

与Scrambled Control相比，qPCR结果表明miR-300 mimic组的ROCK1的表达水平明显降低(P<0.001)，如图2A、C。Western blot结果表明miR-300 mimic组的ROCK1的表达水平明显降低(P<0.001)，如图2B、D。

图2 qPCR和Western blot检测肝癌细胞ROCK1表达

2.3 转染miR-300 mimic后，MTT法和流式细胞术检测HepG2和Huh-7细胞增殖率和Sub-G0/G1比值

MTT结果表明：HepG2和Huh-7细胞随着miR-300 mimic作用时间的增加，细胞增殖率明显降低(P<0.001)，图3A；流式细胞术结果表明：与Scrambled Control相比，miR-300 mimic组的Sub-G0/G1比值水平明显增加(P<0.001)，图3B。

图3 MTT法和流式细胞术检测HepG2和Huh-7细胞增殖率和Sub-G0/G1比值

3 讨论

针对miR-300的研究还比较少，在肿瘤组织中的作用还存在歧义。本研究发现miR-300在肝癌组织和细胞中存在低表达，Xinye Zhang[1]、Yufo Chen[5]和RongchangWang[2]的研究结果与本研究结果一致，但是Junkai Zhang[3]的研究证明miR-300在肝癌组织和细胞中的表达增高，其研究结果与本研究相反。因此，本研究证实了miR-300在肝癌组织和细胞中低表达，与大多数研究结果一致，具有可信度。研究同时发现ROCK1的表达明显增加，与miR-300呈负相关。为了证明miR-300是否通过影响ROCK1的表达，给予miR-300模拟物转染，发现能降低肝癌细胞HepG2和Huh-7中的ROCK1的基因和蛋白水平的表达，因此研究证实了可以通过提高miR-300表达来降低ROCK1的表达来影响肝癌细胞的转归，同时检测肝癌细胞的增殖和分化能力发现miR-300模拟物作用在36 h后细胞增殖率下降，特别是在48 h后有显著的统计学意义，而在48 h细胞的Sub-G0/G1比值显著增加，说明肝癌细胞停止增殖和分化。在Fucheng Zhou[4]的研究中发现miR-300可以通过抑制ROCK1的表达来影响脑胶质瘤的转归，其研究的作用机制与本研究一致。

综上，本研究证实了miR-300可以通过抑制ROCK1影响肝癌的增殖和分化，miR-300有可能作为肝癌治疗的一个新靶点。