人卵丘细胞与壁颗粒细胞的差异性研究进展

高二梦，千日成

众所周知，人体的卵泡发育是一个十分复杂的过程，以原始卵泡为起点，经历了初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡，最终发育为成熟卵泡。颗粒细胞（granulosa cell，GC）是卵母细胞周围的体细胞，与卵母细胞共处于同一卵泡微环境[1]。伴随着卵泡的生长发育，卵母细胞周围的GC同样经历一系列的变化，从最初的单层扁平的前颗粒细胞转变为复层柱状细胞，至窦前卵泡最终发育成为窦卵泡，卵泡周围GC数目明显增多，GC内开始合成并分泌出黏多糖蛋白形成早期的窦腔[2]，至此，GC分化为在空间和功能上不同的2个种群——卵丘细胞（cumulus cell，CC）和壁颗粒细胞（mural granulosa cell，MGC）[3]。

许多学者认为CC与MGC是起源一致、位置不同的同一种细胞，然而从既往发表的文献可以看出，已有关于CC和MGC在功能、基因和细胞谱系等方面的研究，这些研究提示CC与MGC不仅存在着解剖学上的差异，同样存在着功能、基因等方面的差异。而到目前为止，人CC和MGC在代谢方面的差异尚少见报道。学者们认为，CC与MGC之间同样存在着代谢谱的差异。探究CC与MGC之间的差异可能有助于评估卵子质量、提高胚胎质量以及改善妊娠结局，具有重要的临床价值。

1 CC与MGC在概念和发育过程中的差异

卵泡的生长发育受卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）、黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）、类固醇激素以及卵巢和卵母细胞来源的生长调节因子等共同调节。GC的增殖对卵泡生长至关重要，而GC诱导的黄体化则终止排卵前卵泡的生长[4]。

在卵巢中，GC是为卵母细胞生长提供物理支持和微环境的原发细胞类型，当卵母细胞进入生长发育后期，卵泡形成窦腔。从次级卵泡的发育直至形成卵泡窦腔，GC开始分化为MGC和CC[1]。CC围绕在卵母细胞周围，与卵母细胞直接接触形成卵丘-卵母细胞复合物（cumulus-oocyte complex，COC），其数量与卵母细胞密切相关。人类卵母细胞周围的CC数量一直被认为是植入潜力的标志。而MGC则分布在卵泡壁上，与卵泡壁相关，主要承担类固醇生成功能[5]。CC的分化由卵母细胞分泌有效的生长因子（oocytes secrete effective growth factor，OSF）介导，而MGC的形成则受卵泡外、垂体前叶分泌的FSH调控，见图1。MGC中LH受体（LH receptor，LHR）的mRNA表达是GC分化的一个关键标志物，与MGC相比，人CC表达的LHR水平显著降低，但保留了CYP19A1和FSH受体（FSH receptor，FSHR）的表达[6]。卵母细胞通过分泌不稳定的旁分泌信号因子抑制GC向MGC分化，但促进GC向CC分化，以此来调节控制其发育微环境[7]。

图1 GC分化示意图

1.1 CC的概念及发生发展CC是卵母细胞的支持细胞，在卵母细胞发育、成熟、排卵和受精过程中发挥着重要作用[8]。放射冠被认为是卵母细胞周围的第一层CC，CC在靠近卵母细胞的内层比外层更加紧凑，呈向心性膨胀[9]。CC直接接触卵母细胞，胞质突起穿越透明带，与卵母细胞建立缝隙连接，形成COC[1]，该复合物直接影响基因表达和蛋白合成，通过缝隙连接、连接蛋白和旁分泌信号的双向通信调控卵母细胞发育，实现卵丘和卵母细胞间的沟通，导致卵母细胞的分化、扩张和成熟等。缝隙连接由细胞膜间通道蛋白聚合体构成，连接蛋白Cx43和Cx37是与之最密切相关的2个蛋白，该通道允许离子、小分子和小代谢物通过，但不允许蛋白质、核酸等大分子通过。缝隙连接帮助CC为卵母细胞生长发育提供能量和营养，至发育晚期，缝隙连接通过调节通道的减少或关闭促进卵母细胞成熟[1，10]。

1.2 MGC的概念及发生发展MGC排列在卵泡内壁上，与卵泡生长、分化、成熟以及后续的排卵和维持妊娠密切相关，主要执行内分泌功能，其通过分泌蛋白酶促进排卵，排卵后MGC会逐渐转化为产生孕酮的黄体细胞，参与随后的一系列激素调节过程。在LH的作用下，MGC和卵泡膜内层细胞分裂增生，细胞成多边形，胞质内有黄色颗粒和脂滴，呈黄色，称为黄体。颗粒黄体细胞（granulosa lutein cell）由卵泡GC转变而成，位于黄体中央，细胞大，染色淡，主要分泌孕酮。卵泡膜黄体细胞（theca lutein cell）位于黄体周边，表面不平坦，细胞小，染色深，主要合成雌激素。而CC则不像MGC那样黄体化[11]。CC与MGC的相关差异见图2。

图2 CC和MGC的相关差异

2 CC与MGC在功能上的差异

2.1 CC的基本功能众所周知，卵母细胞本身不能合成胆固醇，无法吸取葡萄糖代谢。初级卵泡时期，单层柱状的GC为卵母细胞提供约85%的营养，至窦卵泡期，来源于未分化GC的CC分解胆固醇和葡萄糖，通过缝隙连接为卵母细胞提供必需的氨基酸和核苷酸等营养物质，同样的，卵母细胞也通过缝隙连接传递其分泌的信号分子，调控CC的增殖和膨胀，这是一种双向的“对话”机制。在卵泡发育至窦卵泡后期，CC上大量FSHR合成，产生更多的雌激素，促使卵泡发育，优势卵泡形成，优势卵泡相较于其他群体对FSH更敏感，并产生较高水平的雌激素和调节激素抑制素[12]。卵母细胞在黄体中期LH峰的刺激下完成第一次减数分裂，并停滞于第二次减数分裂中期（Metaphase Ⅱ，MⅡ期），而CC与卵母细胞之间的物质交换很可能是维持减数分裂停滞状态的重要因素。

通过缝隙连接，CC 将环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）转移到卵母细胞，参与抑制卵母细胞成熟。排卵前LH激增，CC与卵母细胞的沟通通道减少甚至关闭，受CC调控的cAMP进入卵母细胞减少，卵母细胞中抑制物cAMP水平下降，减数分裂恢复，卵母细胞成熟[13]。

在卵母细胞成熟过程中，CC表达透明质酸合成酶2（hyaluronate synthase 2，HAS2），分泌富含透明质酸的基质。这种具有黏液弹性的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在CC之间积聚，使得CC彼此相互分离扩散，称为卵丘扩张，这是卵母细胞成熟和排卵的关键步骤。扩张能力是CC分化的一个独特特征，MGC并不具备[5]。

CC合成透明质酸是由FSH诱导的，其机制可能与卵母细胞产生的可溶性因子密切相关。卵母细胞分泌的细胞因子通过CC呈放射状扩散，建立了一个浓度梯度[14]。Nagyova等[9]研究发现，CC及接近COC的MGC中都有透明质酸的合成，而外周MGC的最外层很少或没有检测到透明质酸的活性，但造成这种差异的原因尚存在争议。

2.2 MGC的基本功能CC的功能主要是为卵母细胞服务的，而MGC主要合成类固醇激素，并分泌FSHR和LHR等激素受体，其既是甾体激素的产生部位，也是促性腺激素的作用部位。类固醇激素生物合成的第一步和限速步骤发生在GC的线粒体中，而甾体生成过程主要为胆固醇通过各种甾体激素中间体转化为孕酮、雄激素和雌二醇等[12]。MGC与卵母细胞之间被CC和充满卵泡液的窦腔分开，其某些表型的表达不足使其难以支撑卵母细胞的发育，但可产生甾体激素和生长因子并分泌到滤泡液中，对卵泡的生长发育及排卵发挥重要作用[15]。

FSH可刺激GC将雄激素转化为雌激素，低水平的LH可维持卵泡的生长发育，而排卵则需要高水平的LH。FSH和LH的激增启动排卵，卵泡的一系列激活导致MGC表皮生长因子的分泌，从而进一步促进卵母细胞减数分裂的恢复、卵丘扩张、类固醇生成和黄体化等，这些对受精、胚胎发育和成功植入十分重要[16]。CC同样也可以分泌许多细胞因子和生长因子，这些可能在为卵母细胞提供营养中发挥重要作用，其和MGC对卵母细胞生长发育的作用是一种重叠控制和相互依存的关系[17]。

排卵需要内分泌和旁分泌信号传导途径以及MGC（LHR+）和卵丘GC（LHR-）之间的相互作用，LH效应主要是针对MGC而不是CC，在人卵泡中，LHR/绒毛膜促性腺激素受体（chorionic gonadotropin receptor，CGR）主要在卵泡膜和MGC中表达，在CC中表达较低，在卵母细胞中则不表达[18]。因此，LH激增直接影响MGC，首先MGC对LH反应产生生长因子，并通过旁分泌信号传导和缝隙连接间接影响卵母细胞和CC，由CC通过自分泌强化[19]。

排卵前LH 的激增导致MGC 内cAMP 浓度的急剧上升，随后，在cAMP 的诱导下，双调蛋白（amphiregulin,AREG）、表皮调节素（epiregulin）和β-细胞素（betacellulin）等表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样肽短暂表达，它们是卵丘扩张、卵母细胞成熟和排卵的关键旁分泌介质[13]。至卵泡发育后期，在LH作用下优势卵泡的黄体酮分泌增加，黄体酮是子宫内膜准备和维持妊娠所必需的[19]。排卵前的LH含量也会决定卵泡内类固醇的产量，从而影响妊娠周期中的胚胎植入能力[20]。CC和MGC的功能关系见图3。

图3 CC与MGC功能关系图

3 CC与MGC在转录本与细胞谱系上的差异

现有研究已经提示了CC与MGC存在着转录谱上的差异，与代谢和细胞增殖有关的转录本在CC中富集，而与细胞信号转导和分化有关的转录本在MGC中富集[21]。Wigglesworth等[22]对MGC及CC的转录本进行了研究，发现CYP19A1、CYP11A1、Star、Twsg1、Nppc、Nrip1、Tob1、LHR和Grem1在MGC中的表达高于在CC中的表达，而Npr2、Ldha、Mvk、Eno1、Fdps、Slc38a3、Pfkp、Nog、Tpi1和Smad7则在CC中的表达更高。此外，Grøndahl等[23]在对排卵前CC和MGC相似性、差异性和相关性研究中发现，1 562个基因在CC和MGC中有2倍差异表达，1 406个基因有2～8倍差异性表达，156个基因有8倍差异表达。与MGC相比，CX40在CC中的表达比在MGC中高出16倍以上，CX43在CC中的表达略高（约是MGC中的1.6倍），CC和MGC的表达谱清楚地显示其是具有分化功能的2个细胞群体。

3.1 CC的转录谱系特点与CC相比，MGC中LHR高表达，甾体生成能力强，MGC具有独特的表观遗传特征，存在更多的年龄相关的甲基化差异区域（differential methylation regions，DMR），而且MGC表达的胎盘生长因子（placenta growth factor，PLGF）是灵长类动物排卵、卵泡血管生成和黄体化所必需的。由此可见，MGC在卵泡形成和与卵母细胞的相互作用中发挥着关键作用[24]。LHR基因编码一种糖蛋白受体，属于G蛋白耦联受体，LH与LHR结合激活相应蛋白，导致细胞内cAMP水平增高和前列腺素合成增加[25]。LHR受体在膜细胞和MGC中的高表达，对产生雄烯二酮、睾酮和孕酮以及排卵、卵泡成熟、黄体化和黄体形成十分必要，优势卵泡的GC最终获得LHR，这是排卵前卵泡的标志[12]。LH激增导致排卵、黄体化，并导致形成黄体LHR的蛋白和mRNA水平下调[26]。

3.2 MGC的转录谱系特点与MGC相比，CC具有高抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）表达、高增殖率、低LHR表达、低甾体生成能力的特点。在CC中，重组蛋白gremlin（GREM）、HAS2和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）等高表达可作为优质胚胎的指标。一些基因的表达，例如PTX3，可作为评估卵母细胞和胚胎质量的生物标志物[7，27]。一些特定转录本的表达，如AMH和Slc38a3等在CC中的表达水平高于MGC[22]。AMH是一种糖蛋白激素，属于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，通过AMH受体Ⅱ发挥生物学功能，其比FSH、雌二醇、抑制素B和窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）更早反映卵巢储备随年龄增加而下降的趋势。同时，AMH基因是FOXO1/3和激活素的潜在靶点，转录因子家族成员FOXO在特定的卵巢细胞中高度表达，被认为是卵泡生长和（或）凋亡的关键调节因子[4]。而晚期窦卵泡的CC表达的Slc38a3与卵母细胞的成熟有关，其可编码中性氨基酸转运体（neutral amino acid transporter），负责CC与卵母细胞间的氨基酸转运，而在GC中则没有或很少有Slc38a3的表达。

4 结语

在窦卵泡期，CC由OSF介导形成，围绕在卵母细胞周围，为卵母细胞提供必需的氨基酸和核苷酸等营养物质。MGC在FSH趋化下排列在卵泡壁周围，执行着类固醇生成等功能。而在基因表达上，既往研究表明，与代谢和细胞增殖有关的转录本在CC中富集，而与细胞信号转导和分化有关的转录本在MGC中富集。总之，CC与MGC并非学者们固有认知里的位置不同的同一种细胞，两者存在着多方面的差异性，而且CC和MGC在代谢组学上可能同样存在差异性，但这一点尚无任何报道。卵泡微环境中的代谢改变尤其是脂质代谢对维持正常的生殖功能至关重要，脂质代谢通过调节颗粒细胞增殖、凋亡、能量代谢和类固醇激素合成对卵泡成熟具有重要作用[28]。研究表明，剥去周围CC的卵母细胞具有低糖酵解活性。Purcell等[29]发现，胰岛素受体和胰岛素信号传导所需的许多成分同时存在于CC和卵母细胞中，胰岛素刺激的葡萄糖摄取发生在小鼠的致密和膨胀的CC中，也发生在人类的CC中，而卵母细胞中未发现胰岛素刺激的葡萄糖摄取的发生。CC和MGC在功能和基因表达上存在差异，包括参与糖代谢通路、脂质代谢通路和类固醇代谢通路的基因差异，由此推测，CC和MGC在发育的不同阶段同样存在着代谢组学上的差异。GC中富集大量的代谢产物[28]，但两者之间在代谢谱表达上的差异性尚有待进一步的研究。探索两者之间的差异可能为学者们开发评估卵母细胞和胚胎质量新的标志物提供新思路，这对改善妊娠结局具有重要的临床意义。