围生期低剂量双酚A对子代雄鼠生精功能的影响

白银阳，熊芳，张昀，陈洁，徐丽爽，汪敏

环境雌激素对男性生殖健康的影响越来越受到社会的关注。塑料制品双酚A（bisphenol A，BPA）是一种与人类生活密切相关，并对人类生殖健康产生广泛影响的环境雌激素[1-2]。美国的一项调查研究显示，90%的人群尿液中都能检测到BPA。BPA易通过血胎和血脑屏障，在人羊水、母体和胎儿血、胎盘和母乳中均可检测到[3]，同时胎儿肝脏的解毒代谢功能不健全，使得围生期对BPA的生殖毒性作用尤其敏感[4]。大量文献报道，低剂量BPA暴露能够损害雄性动物生精功能[4-5]，而关于围生期低剂量BPA对睾丸生精过程的影响鲜有报道。

睾丸的精子发生包括从精原细胞到初级精母细胞的有丝分裂和精母细胞到精子细胞的减数分裂两个阶段。生精细胞的有丝分裂和减数分裂受到许多调节蛋白的调控。睾丸周期蛋白cyclins及其激酶cdks基因（cdk1和cdk2）对于生精细胞分裂过程的调控至关重要[6]。精子发生过程还受下丘脑-垂体-睾丸轴的调控，下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotrophin-releasing hormone，GnRH）神经元的活性主要受到下丘脑弓状核（ARC）kisspeptin神经元的正向调控[7]。本文以母鼠围生期即妊娠第10天到分娩后第7天作为低剂量BPA的暴露时间窗，建立子代雄鼠模型，研究BPA对子代雄鼠生精过程早期的影响，通过观察下丘脑视前区（POA）-GnRH和ARCkiss1的表达以及睾丸生精相关调节蛋白的表达探讨BPA影响生精过程的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年雌、雄性SD大鼠（体质量250～300 g）购自上海斯莱克实验动物中心[许可证：SCXK（沪）2007-0005]，饲养条件：恒定温度（22～25 ℃）、恒定湿度（40%～50%），12 h人工照明。雌性∶雄性=1∶1合笼，置于特定带托盘的交配笼，每日清晨观察托盘中有无乳白色阴道栓，发现阴道栓者定义为妊娠第0天。

1.2 主要试剂配制BPA和实验用茶油购自美国Sigma公司。小鼠抗kisspeptin抗体购自日本Takeda药品公司，小鼠抗GnRH抗体购自美国Millipore公司，均为单克隆抗体，适合免疫组织化学法实验。羊抗小鼠生物素标记二抗购自美国Bioworld公司；实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime PCR）试剂盒购自日本Takara公司；苏木素、伊红购自国药集团化学试剂有限公司；激素放射性免疫试剂盒购于北京北方生物技术研究所。

1.3 BPA染毒

1.3.1 分组和BPA剂量妊娠母鼠随机分为2组，每组10只。根据现在对低剂量研究的热点及相关文献报道[8]，本研究确定妊娠母鼠暴露BPA的剂量为2 μg/（kg·d）。需要说明的是，出生前后是大鼠下丘脑kisspeptin神经元分化形成的关键时期，为探讨BPA作用于子代雄鼠的中枢机制，本研究确定母鼠的BPA染毒时间为妊娠第10天至分娩后第7天。再者，本文“低剂量”BPA[2 μg/（kg·d）]是妊娠母鼠和分娩后母鼠（哺乳期）的每日染毒剂量，子代“BPA染毒”剂量、特别是通过母乳间接接触BPA的实际剂量本文并未探究。

1.3.2 BPA染毒处理妊娠第10天开始至分娩后第7天，一组妊娠母鼠每日皮下注射BPA（其雄性子代鼠为BPA染毒组），另一组妊娠母鼠每日皮下注射等体积的溶剂橄榄油（其雄性子代鼠为对照组）。本文预实验动态观察睾丸发育结果显示，大鼠支持细胞大约在出生后18 d完成增殖，睾丸生精小管内粗线期精母细胞在出生后21 d开始形成，圆形精子细胞在出生后24 d开始出现。因此，子代雄鼠分别在第一波生精发生的关键时期即出生后18、21、24 d（PND18/21/24）进行取材研究（每组每个时间点各10只）。

1.4 标本采集

1.4.1 脑组织每组10只雄性子代大鼠，称重后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后仰卧位固定，直接取出脑组织，液氮速冻后置于-20 ℃冰冻切片机（CM1510S，德国Leica公司）上进行修饰，借助于体视显微镜分离下丘脑，分别切约2 mm×2 mm×2 mm的包含POA和ARC核团的脑组织，保存于-80 ℃冰箱。大致的核团定位方法：POA（前囟点前0.6 mm至前囟点后0.48 mm）和ARC（前囟点后1.8 mm至前囟点后3.96 mm），这些标志和参数在实际操作时可参考。

1.4.2 睾丸组织充分暴露视野，取出睾丸并称质量，一侧放入Bouin液中固定，以观察组织形态；另一侧睾丸于冰上迅速去包膜，-20 ℃冰箱冷冻后切分为5 mm×5 mm×5 mm的小块，液氮速冻后保存于-80 ℃，用于mRNA测定。

1.5 睾丸组织学睾丸用Bouin液固定，石蜡包埋，用石蜡切片机切片厚度为5 μm，切片贴于载玻片上。常规HE染色后光镜观察组织形态。并统计以下指标。

1.5.1 生精小管直径在放大10倍物镜下，随机选取200个生精小管，测量其直径。

1.5.2 圆形精子细胞数量和管腔率在放大20倍物镜下，“S”形移动视野，选取20个测试视野，统计5张切片，计数总管腔数目、含圆形精子细胞的管腔数目和圆形细胞数量，圆形精子细胞管腔率=含圆形精子细胞的管腔数目/总管腔数目。

1.5.3 各级生精细胞体积采用“121个点”数点法检测支持细胞和各级生精细胞的体积。在放大100倍物镜下，选取5张切片，每张切片随机选择20个规则圆形或椭圆形的生精小管。用含有121个交叉点的目镜观察，计数交叉点落在支持细胞和各级生精细胞胞核上以及管腔内的个数，并计算它们占总点数（121个点）的比例（点比率），支持细胞和各级生精细胞体积等于总睾丸体积（等于睾丸质量）乘点比率[9]。睾丸各级生精细胞体积可作为细胞数量的指标。

1.6 激素测定采用放射免疫方法测定检测血浆中黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）以及睾酮（testosterone，T）和雌二醇（estradiol，E2）的水平。激素放射性免疫试剂盒购于北京北方生物技术研究所。

1.7 POA和ARC组织kiss1/GnRH mRNA表达、睾丸组织cyclin A1/cyclin B/c-jun/c-fos mRNA表达的检测将下丘脑和睾丸组织置于离心管中，每50～100 mg组织加入1 mL Trizol RNA提取液，匀浆，室温放置15 min。先后加入0.2 mL氯仿、0.5 mL异丙醇，分别混匀、离心、弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤。用50 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA沉淀，核酸蛋白检测仪测定样品OD260、OD280和RNA的浓度。样品RNA浓度统一稀释到0.25 μg/μL。在0.2 mL无核糖核酸酶（Rnase）的PCR管中依次加入逆转录试剂，混合后置于PCR扩增仪中进行逆转录反应：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃终止反应。转录后的cDNA加DEPC水稀释10～20倍混匀并分装，于-20 ℃保存。引物序列由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

应用日本Takara公司的SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR。将配制好的反应体系加入到96孔板中，每个样品的目的基因和内参基因都设3个平行反应管。利用ABI 7300型实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增。每个样品设3个复孔，Ct值取平均值，数据采用2-ΔΔCt法分析：ΔCt=Ct目的基因－Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组。

1.8 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BPA对子代雄鼠睾丸精子发生的影响子代雄鼠出生后24 d的睾丸生精小管内出现圆形精子细胞，BPA组子代雄鼠睾丸生精小管内圆形精子细胞数量明显多于对照组，见图1。24日龄BPA组子代雄鼠的睾丸生精小管直径、圆形精子细胞数量和圆形精子细胞管腔率较对照组增加（均P＜0.05）；而BPA组雄鼠睾丸内支持细胞、精原细胞和精母细胞的体积与对照组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 围生期低剂量BPA暴露对子代雄鼠睾丸精子发生的影响（）

表2 围生期低剂量BPA暴露对子代雄鼠睾丸精子发生的影响（）

图1 雄鼠睾丸组织（HE染色×100）

2.2 BPA组子代雄鼠的睾丸精子发生调控因子表达睾丸周期蛋白cyclins和AP-1家族基因在精子发生中发挥关键调节作用。PCR结果显示，BPA组子代雄鼠出生后21 d和24 d的cyclin A1基因表达水平比对照组升高（P＜0.01，见图2A），cyclin B的基因表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05，见图2B）。c-jun和c-fos是cyclin A1的重要正向调控因子。本研究发现，21日龄BPA组子代雄鼠的c-jun和c-fos基因表达水平也比对照组明显增加（P＜0.01，见图2C、2D）。

图2 围生期BPA暴露对子代雄鼠睾丸精子发生调控因子的影响

2.3 BPA对子代雄鼠生殖激素的影响垂体和性腺分泌的生殖激素可调节睾丸的精子发生。本研究结果显示，21日龄和24日龄BPA组子代雄鼠血浆FSH和LH的水平高于对照组（P＜0.05，见图3A、3B），而出生后18 d 2组雄鼠的血浆FSH和LH水平差异无统计学意义（P＞0.05）；此外，2组雄鼠血浆T和E2的水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，见图3C、3D）。

图3 围生期低剂量BPA暴露对子代雄鼠生殖激素的影响

2.4 BPA对雄鼠下丘脑GnRH和kiss1基因表达的影响垂体促性腺激素的分泌受到下丘脑分泌GnRH的调控，GnRH的释放又接受下丘脑kisspeptin神经元的参与调节。为探讨BPA导致促性腺激素水平升高的可能原因，本研究检测了21日龄雄鼠下丘脑GnRH和kiss1的基因表达水平。BPA组雄鼠下丘脑GnRH和kiss1 mRNA的表达水平较对照组升高，差异有统计学意义（GnRH：P＜0.05，kiss1：P＜0.01，见图4A、4B）。

图4 围生期BPA暴露对子代雄鼠下丘脑POA-GnRH和ARC-kiss1基因表达的影响

3 讨论

3.1 围生期接触低剂量BPA促进子代雄鼠精子发生BPA作为环境内分泌干扰物，广泛存在于我们的日常生活中，发挥模拟或拮抗内源性雌激素的作用，干扰机体正常的生殖内分泌调节[1-2]。Atanassova等[9]发现，新生儿期接触低剂量BPA可促进生精发生的过程。与其结论相一致的是，本研究发现，围生期接触低剂量BPA也可促进子代雄鼠睾丸生精发生，与其不同的是，本文中BPA暴露的时期为围生期，母体是BPA的直接暴露对象，而子代雄鼠只是通过母体血液或母乳的间接接触进行染毒，因此子代雄鼠的具体染毒剂量尚不明确。此外，本研究显示，围生期接触低剂量BPA促进子代雄鼠（青春前期）睾丸内圆形精子细胞数量显著增加，但并不影响睾丸支持细胞、精原细胞和精母细胞的数量。睾丸的精子发生包括从精原细胞到初级精母细胞的有丝分裂和精母细胞到精子细胞的减数分裂两个阶段。在生精细胞分裂中检测支持细胞和各级生精细胞的数量，可用于评估睾丸的第一波生精过程[10]。圆形精子细胞的出现反映第一波精子发生减数分裂的完成。本文提出，围生期接触低剂量BPA可促进睾丸第一波精子发生的减数分裂，刺激睾丸生精小管内圆形精子细胞的生成。而不同剂量的环境雌激素对生殖发育的影响却截然不同。研究发现，新生儿期接触高剂量己烯雌酚（环境雌激素）能干扰雄鼠生殖发育，而低剂量己烯雌酚却能促进雄鼠性发育和生精发生。也有报道青春前期接触低剂量BPA可抑制睾丸类固醇生成酶的活性进而减少睾酮的生成[5]。因此，BPA对雄性生殖发育影响与暴露时期及其剂量密切相关。

3.2 围生期接触低剂量BPA提高睾丸特异性周期蛋白的基因表达为了探讨围生期低剂量BPA暴露促进生精细胞减数分裂的可能机制，我们进一步检测了减数分裂相关调节因子的表达活性。本研究发现，围生期接触低剂量BPA导致青春前期子代雄性睾丸内cyclin A1的基因表达显著增加，而同家族成员cyclin B的表达却无显著改变。睾丸周期蛋白在生精细胞分裂过程中发挥至关重要的作用。睾丸特异性周期蛋白cyclin A1主要表达在粗线期晚期和终变期精母细胞，参与减数分裂G1/S和G2/M期的转变，在精母细胞第一次减数分裂过程中发挥关键作用，生精细胞减数分裂启动过程中cyclin A1的表达显著增加[11-12]。Cyclin A1的编码基因Ccna1敲除雄鼠生精过程被阻断在第一次减数分裂前，表现为不育[11]。提示，BPA可能通过增加睾丸内cyclin A1的表达促进生精细胞减数分裂。本研究还发现，围生期低剂量BPA暴露还能增加21日龄子代雄鼠睾丸内c-jun和c-fos的基因表达。AP-1家族成员基因c-jun和c-fos是cyclin A1上游重要的正向调节因子，c-jun和c-fos可形成异二聚体，共同提高cyclin A1基因的表达[13]。提示，围生期接触低剂量BPA可能通过提高c-jun和c-fos的表达，增强cyclin A1基因的转录活性，进而促进睾丸精子发生的减数分裂过程。

3.3 围生期接触低剂量BPA促进子代雄鼠促性腺激素的分泌垂体分泌的FSH和睾丸分泌的睾酮是启动和维持精子发生的主要因素。FSH对支持细胞的增殖和活性起决定性作用，FSH通过调节因子直接或间接促进支持细胞的增殖[14]。FSH还能够增加生精细胞的数量，促进精母细胞进入减数分裂。而睾酮能够促进生精细胞减数分裂的完成[15]。LH作用于睾丸间质细胞，促进睾酮的生成。本研究发现，围生期接触低剂量BPA导致子代雄鼠血浆中FSH和LH的水平显著增加，但并不改变血浆中睾酮和E2的水平。推测，BPA组雄鼠血浆FSH和LH水平的升高是促进睾丸精子发生的关键因素。与血浆FSH的变化不一致，2组间睾丸支持细胞的体积（代表数量）并无差异，分析原因为支持细胞的增殖过程一般在出生后18 d之前结束，而BPA组雄鼠FSH水平的升高出现在出生后21 d之后，因此2组间支持细胞的数量无显著差异。尽管BPA组雄鼠血浆LH的水平显著增加，血浆睾酮的水平却无明显变化，体外研究发现，BPA可干扰人蜕膜细胞LH受体的表达[16]，因此推测BPA对睾丸生精细胞LH受体存在潜在影响。以上结果提示，围生期低剂量BPA暴露可能通过增加促性腺激素的生成，促进睾丸的生精发生。C-fos基因的表达受到促性腺激素的正向调节[17]。本研究中BPA组雄鼠c-fos基因表达的增加可能是受到促性腺激素的间接调节作用，但尚不能排除BPA对睾丸基因表达直接作用。

3.4 围生期接触低剂量BPA提高子代雄鼠下丘脑ARC-kiss1和POA-GnRH基因表达文献报道，围生期接触高剂量BPA能够增加子代雄鼠下丘脑kiss 1和GnRH基因的表达[18]。与其报道相一致，本研究发现，围生期接触低剂量BPA就能增加ARC-kiss 1和POA-GnRH的基因表达。雄鼠ARC-kiss 1在出生后3 d开始表达，青春期启动时ARC-kiss 1的基因表达急剧增加[19]。大鼠青春期ARC-kiss 1基因的表达水平是幼年期的1.5倍[20]。95%的GnRH神经元上表达kisspeptin的受体GPR54，当下丘脑ARC-kisspeptin神经元活性增强时，可通过GPR54受体激活GnRH神经元，启动下游的生殖内分泌轴[7]。提示围生期低剂量BPA暴露能够提前激活ARC-kisspeptin系统，促进GnRH的合成和释放，提高血浆FSH水平，促进睾丸精子发生。

4 结语

BPA对人类生殖健康的影响已受到广泛关注，既往研究主要集中在BPA的生殖毒性（精子数量减少、精子畸形率增加等）和导致生殖发育异常（雌性性早熟等）。与既往研究结果不同的是，本研究发现围生期接触低剂量BPA可促进子代雄鼠睾丸的精子发生，除BPA对睾丸的直接作用外，BPA还可能通过激活ARC-kisspeptin神经元，提前启动生殖内分泌轴，导致睾丸生精发生提前。但是BPA导致子代雄鼠生精发生提前的具体作用靶点尚不明确，还需要进一步更深入的研究。作为人类生活中塑料制品的主要成份，BPA对人和动物生殖健康的影响越来越受到人们的重视，寻找有效的并且安全的BPA替代物是许多研究者们不断努力的方向。