美洲大蠊多肽PAE2逆转耐药细胞株多药耐药性的研究

王彦权，张鸿翰，吕 鸿，李彩琳，Najib Mohammerd，彭 芳，吴定宇

（1. 大理大学药学院，云南大理 671000；2. 大理大学资产与实验室管理处，云南大理 671000）

肝癌是世界上高发病率的肿瘤之一，据国家卫生健康委员会发布的《原发性肝癌诊疗规范（2019年版）》，原发性肝癌是全球导致死亡的第二大癌症，86%的肝癌发生于发展中国家，我国2018年肝癌死亡率占世界的46.71%，晚期肝癌患者的总体5年生存率低于10%〔1-2〕。肝癌患者对全身化疗的肿瘤应答率低，容易诱导肿瘤细胞产生多药耐药性〔3〕。多药耐药性指肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，是导致肿瘤化学治疗失败的最重要原因，对肝癌的转移和复发具有重要影响〔4〕。人体内一旦获得了多药耐药性，化学治疗药物的抗肿瘤作用就会降低，而现有的抗晚期肝癌药物大部分都容易产生多药耐药性作用〔5〕。索拉非尼是首个被美国食品药品监督管理局批准用于治疗人肝细胞癌（HCC）晚期的分子抑制剂，因为耐药性的产生而使其在临床上的应用受阻〔6〕。用于改善多药耐药的化学药品种类较多，但往往只能针对其中的一种机制进行逆转，逆转效率不高，临床应用受到限制。中草药具有多靶点、多阶段性作用的特点，可针对肿瘤多药耐药性的多种机制进行有效逆转。本课题组在前期研究中构建了HepG2/ADM细胞株，在细胞凋亡实验中证明了美洲大蠊粗提物脱脂膏和CⅡ-3的抗HCC作用〔7〕，并发现其对多药耐药性有一定的逆转作用，主要是通过促进耐药细胞株细胞凋亡，使P-gp mRNA表达量下降，抑制耐药蛋白表达从而增加细胞内药物聚集发挥作用。同时，我们明确了美洲大蠊中抗肿瘤活性成分主要为小分子肽类，并从中分离得到了一系列小肽，命名为PAE系列多肽，其中美洲大蠊多肽PAE2的抗肿瘤效果较好〔8〕。但是PAE2对HCC多药耐药的作用尚未见研究报道。

本研究以耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象，使用美洲大蠊多肽PAE2进行体外干预，观察PAE2是否具有抗HCC细胞多药耐药的作用。

1 材料

1.1 仪器CKX41SF型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；SN255939型酶标仪、核酸浓度分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；7500型荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.2 药品与试剂美洲大蠊多肽PAE2（纯度98.06%）为实验室制备；索拉非尼（批号：1017R021）及长春新碱（批号：070603C）均购于北京索莱宝科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-FU，批号：WXBC2167V）购于国药集团化学试剂有限公司；阿霉素（批号：021411010）、噻唑蓝溶液（MTT，批号：C0009-2）、PCR逆转录试剂盒（批号：070618190813）及PCR荧光试剂盒（批号：032919200421）均购于上海碧云天生物科技有限公司；环磷酰胺（批号：980910）购于中国食品药品鉴定研究院；奥沙利铂（批号：20090202）购于美国Target Mol公司；胎牛血清（FBS，批号：18050302）购于美国Gibco公司；RMPI 1640培养基（批号：8120199）、Trizol试剂（批号：15596-026）均购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 细胞HCC敏感细胞株BEL-7402（批号：MXC050）、耐5-FU HCC细胞株BEL-7402/5-FU（批号：MXC049）均购于上海美轩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 药液的制备用超纯水将5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺、奥沙利铂5种抗肿瘤药分别配制成1 mg/mL的药物母液，美洲大蠊多肽PAE2溶液配制成50 mg/mL的母液，于4 ℃保存备用，试验时用RPMI 1640培养基等比例稀释至试验所需的不同浓度。

2.2 MTT法检测细胞的多药耐药性取培养至对数生长期的BEL-7402细胞和BEL-7402/5-FU细胞，接种于96孔板上。按照MTT实验操作，分别加入5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺、奥沙利铂溶液，其中5-FU、长春新碱、环磷酰胺、奥沙利铂的浓度为5、10、20、40、80 μg/mL，阿霉素的浓度为0.162 5、 0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0 μg/mL，并设置溶剂对照孔和空白对照孔（只含细胞，不加药物），按以下公式计算药物对细胞生存率和耐药倍数（resistance index，RI）：细胞生存率 = （不同浓度药物的OD值-溶剂对照孔的OD值）/（空白对照孔的OD值-溶剂对照孔的OD值）×100 %，RI=（BEL-7402/5-FU细胞株IC50）/（BEL-7402敏感细胞株IC50）。

2.3 MTT法检测美洲大蠊多肽PAE2的细胞毒性作用将BEL-7402/5-FU细胞株接种于96孔板上，按照MTT实验操作，各孔加入不同浓度的美洲大蠊多肽PAE2溶液，进行MTT检测，确定美洲大蠊多肽PAE2发挥细胞毒性作用的药物剂量区间和有效作用时间。选取IC20的美洲大蠊多肽PAE2进行药物逆转多药耐药试验，计算细胞生存率和美洲大蠊多肽PAE2的逆转指数（reversal factor ，RF）。RF =（PAE2处理后BEL-7402/5-FU细胞株IC50）/（未处理BEL-7402/5-FU细胞株IC50）。

2.4 荧光定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测多药耐药相关蛋白mRNA的表达水平试验设置6个试验组，分别为敏感组、耐药细胞组、索拉非尼（阳性药物）对照组和美洲大蠊多肽PAE2低、中、高剂量组。在培养皿中对耐药细胞进行接种与给药培养。给药结束后，每皿中加入Trizol试剂1 mL，冰浴放置5 min后，用细胞刮刀收集细胞至1.5 mL EP管中，按照Trizol法提取总RNA。用焦碳酸二乙醇水20～50 μL溶解RNA样品，在核酸浓度分析仪上进行RNA浓度检测。取总RNA按照逆转录反应体系逆转录成cDNA，反应条件为42 ℃，60 min；80 ℃，10 min。将cDNA 置于实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）上游序列为5′-CCCAAACATTGACAAATCCTAACC-3′，下游序列为5′-CAACCAAGGAGGGTACCAGATG-3′；DNA拓扑异构酶Ⅱ（topo-isomerase typeⅡ, TopoⅡ）上游序列 为5′-GAAACGGAATCCTTGGTCAGAT-3′，下游序列为5′-TTTCGGCTGCTGCTCTCCTA-3′；谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase-π, GST-π）上游序列为5′-CTGGAAGGAGGAGGTGGTG-3′，下游序列为5′-GACGCAGGATGGTATTGGAC-3′；β-actin上游序列为5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游序列为5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。扩增条件为95 ℃ 2 min预变性，随后95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s延伸。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算各目的基因的相对表达量。

2.5 免疫细胞化学染色法检测多药耐药相关蛋白的表达水平取处于对数生长期的所有组别耐药细胞株，给药处理48 h后，4%的多聚甲醛避光处理20 min，将3%过氧化氢溶液与甲醇溶液按一定比例（1∶4）滴于爬片上，封闭10 min后加入一抗孵育过夜，PBS清洗后加入二抗，室温孵育30 min，随后根据DAB显色试剂盒进行操作，于倒置相差显微镜下观察。采用Image J软件计算出相对光密度值（ROD），其中阳性指标为棕色颗粒团块，阴性指标为紫蓝色团块，并进行统计学分析。

2.6 统计学处理采用SPSS 17.0软件处理试验数据，数据分析选择最低显著性t检验（LSD-t），数据以表示，P< 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 耐药性检测

3.1.1 细胞的多药耐药性检测结果 5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂对HCC敏感细胞株BEL-7402的IC50分别为（12.60±2.48）、（1.58±0.26）、（26.73±1.54）、（28.12±2.61）、（21.21±4.02） mg/mL；5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂对HCC耐药细胞株BEL-7402/5-FU的IC50分别为（7 398.27±330.77）、（6.44±0.39）、（78.01±4.90）、（177.74±4.29）、 （122.75±4.94） mg/mL。计 算 得BEL-7402/5-FU细胞对5-FU的耐药倍数为587.16，对阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂的耐药倍数分别为4.08、2.92、6.32、5.79。结果表明，BEL-7402/5-FU细胞对5-FU显示出较强的耐药性，对阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂产生了交叉耐药性，即BEL-7402/5-FU细胞株为多药耐药细胞。

3.1.2 美洲大蠊多肽PAE2对敏感细胞和耐药细胞的毒性作用 美洲大蠊多肽PAE2对敏感细胞株 BEL-7402的IC5、IC10、IC20、IC50分别为（53.73±2.91）、 （109.46±6.46）、（332.22±8.32）和（2 155.84±29.05） mg/mL，对耐药细胞株BEL-7402/5-FU的IC5、IC10、IC20、IC50分 别 为（11.48±1.05）、（56.35±5.11）、 （105.23±4.34）和（1 165.53±63.01）mg/mL。结果显示，耐药细胞株BEL-7402/5-FU对美洲大蠊多肽PAE2更为敏感。

3.1.3 美洲大蠊多肽PAE2逆转BEL-7402/5-FU多药耐药性的检测结果 本研究选择IC20高剂量的美洲大蠊多肽PAE2对BEL-7402/5-FU细胞进行多药耐药的逆转试验。将PAE2分别与5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂联合使用，并计算联合用药后BEL-7402/5-FU的细胞生存率与上述5种药物的IC50。结果显示，合用高剂量的美洲大蠊多肽PAE2后，5-FU、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和奥沙利铂的IC50分别为（12.73±1.19）、（0.90±0.06）、（15.22±2.82）、（12.78±1.42）、（46.68±0.42） mg/mL，逆转指数分别为581.17、7.16、5.13、13.91、2.63。综上所述，美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药细胞有较好的逆转耐药作用。见表1。

表1 不同药物对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的影响（， n=6 ）

表1 不同药物对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的影响（， n=6 ）

药物IC50 /（mg/mL）RI RF BEL-7402 BEL-7402/5-FU BEL-7402/5-FU+PAE2 5-FU 12.60 ± 2.48 7 398.27 ± 330.77 12.73 ± 1.19 587.16 581.17阿霉素 1.58 ± 0.26 6.44 ± 0.39 0.90 ± 0.06 4.08 7.16长春新碱 26.73 ± 1.54 78.01 ± 4.90 15.22 ± 2.82 2.92 5.13环磷酰胺 28.12 ± 2.61 177.74 ± 4.29 12.78 ± 1.42 6.32 13.91奥沙利铂 21.21 ± 4.02 122.75 ± 4.94 46.68 ± 0.42 5.79 2.63

3.2 RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶mRNA表达水平的影响与敏感细胞株相比，耐药细胞株的PKC、TopoⅡ及GST-π均呈高表达状态，差异有统计学意义（P< 0.05）。使用药物作用耐药细胞后，索拉非尼与中剂量（IC10）和高剂量（IC20）的美洲大蠊多肽PAE2可明显下调PKC mRNA表达（P< 0.05）；索拉非尼能明显下调TopoⅡ及GST-πmRNA的表达 （P< 0.05），不同剂量组的美洲大蠊多肽PAE2也能明显下调TopoⅡ及GST-πmRNA的表达（P< 0.05），并且各剂量组间差异无统计学意义（P> 0.05）。见表2。

表2 美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶mRNA表达水平的影响（，n=5）

表2 美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶mRNA表达水平的影响（，n=5）

注：与敏感细胞组比较*P< 0.05；与耐药细胞组比较#P < 0.05；与索拉非尼（阳性药物）对照组比较△P< 0.05；与美洲大蠊多肽PAE2低剂量组比较○P < 0.05；与美洲大蠊多肽PAE2中剂量组比较□P < 0.05。

组别 PKC相对含量 TopoⅡ相对含量 GST-π相对含量敏感细胞组 1.00 1.00 1.00耐药细胞组 4.71±0.69* 1.18±0.16* 10.63±1.34*索拉非尼（阳性药物）对照组 0.44±0.09# 0.02±0.00*# 4.42±1.31*#美洲大蠊多肽PAE2 低剂量组 7.12±0.69*#△ 0.55±0.14*#△ 6.94±2.13*#△美洲大蠊多肽PAE2 中剂量组 1.83±0.12*#△○ 0.66±0.16*#△ 5.86±0.52*#美洲大蠊多肽PAE2 高剂量组 0.97±0.10#○□ 0.52±0.12*#△ 5.41±1.92*#

3.3 免疫细胞化学法检测美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶蛋白表达水平的影响免疫细胞化学染色法实验结果表明：敏感细胞株和耐药细胞株均大量表达PKC，但耐药细胞的表达量明显高于敏感细胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均能对PKC出现抑制作用，且美洲大蠊多肽PAE2作用呈剂量依赖性。其中，高剂量的美洲大蠊多肽PAE2的作用效果与索拉非尼相当（P> 0.05）。见图1、表3。

表3 美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶相对光密度值（，n=5）

表3 美洲大蠊多肽PAE2对多药耐药相关酶相对光密度值（，n=5）

注：与敏感细胞组比较*P< 0.05；与耐药细胞组比较#P < 0.05；与索拉非尼（阳性药物）对照组比较△P< 0.05；与美洲大蠊多肽PAE2低剂量组比较○P < 0.05；与美洲大蠊多肽PAE2中剂量组比较□P < 0.05。

组别 PKC TopoⅡ GST-π敏感细胞组 0.34±0.08 0.12±0.01 0.95±0.04耐药细胞组 0.83±0.10* 0.13±0.00* 1.10±0.05*索拉非尼（阳性药物）对照组 0.24±0.09*# 0.09±0.01*# 0.71±0.06*#美洲大蠊多肽PAE2 低剂量组 0.44±0.07*#△ 0.12±0.00#△ 0.87±0.07*#△美洲大蠊多肽PAE2 中剂量组 0.41±0.10*#△ 0.12±0.00#△ 0.78±0.10*#△○美洲大蠊多肽PAE2 高剂量组 0.22±0.08*#○□ 0.10±0.00*#△○□ 0.65±0.04*#○□

图1 美洲大蠊多肽PAE2对PKC蛋白表达的影响（× 200）

敏感细胞株和耐药细胞株均大量表达TopoⅡ，但耐药细胞的表达量高于敏感细胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均对TopoⅡ有抑制作用。其中，高剂量的美洲大蠊多肽PAE2与索拉非尼相比虽具有统计学差异（P> 0.05），但其抑制效果不如索拉非尼。见图2、表3。

图2 美洲大蠊多肽PAE2对TopoⅡ蛋白表达的影响（× 200）

耐药细胞株与敏感细胞株相比，GST-π蛋白呈高表达状态（P< 0.05），经药物处理后，GST-π蛋白的表达量受到了不同程度的抑制（P< 0.05），其中，索拉非尼与高剂量的美洲大蠊多肽PAE2的下调作用较优（P< 0.05），两者之间的作用差异无统计学意义；美洲大蠊多肽PAE2的下调作用呈现出剂量依赖性（P< 0.05）。见图3、表3。

图3 美洲大蠊多肽PAE2对GST-π蛋白表达的影响（× 200）

4 讨论

HCC的耐药机制较为复杂，其中包括多药耐药酶介导的多药耐药性，包括GST-π、PKC、TopoⅡ等〔9〕。PKC是重要的信号分子家族，具有调节细胞增殖、分化、转化和凋亡的作用，并且在肿瘤的促进及发展过程中也参与表达；GST-π可以保护细胞免受细胞毒性及致癌的危险，被认为是肿瘤发展的标志酶，并且在肿瘤细胞中呈现出高表达状态；TopoⅡ能促进肿瘤细胞增殖，与恶性肿瘤的进程有着密不可分的关系，并且高表达于肝癌患者中。

试验证明了美洲大蠊多肽PAE2具有逆转多药耐药的作用。通过RT-PCR法在体外的研究结果表明，与BEL-7402细胞株相比，在BEL-7402/5-FU细胞株体外GST-π、PKC、TopoⅡ的mRNA表达量均明显上调，差异具有统计学意义，可以初步确定BEL-7402/5-FU细胞株产生多药耐药性的作用与GST-π、PKC、TopoⅡ高表达导致药物外排有关，从而使药物摄取不足，细胞内的药物代谢异常，并且在给药后均呈现出下降的效果，但美洲大蠊多肽PAE2下调作用并没有随着浓度呈现出剂量依赖的趋势，并且各剂量组之间的抑制作用也各有不同，这可能与美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤细胞的双向调节作用有关，提示了肿瘤细胞活性分子的复杂性，也可能与美洲大蠊多肽PAE2未达到有效治疗浓度有关。

在蛋白表达水平，对于多药耐药相关酶而言，GST-π、TopoⅡ在BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞株中的表达水平，差异具有统计学意义；经过不同受试药物处理后，GST-π、TopoⅡ的表达量也有所下调，存在统计学差异 ；特别是PKC在BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞株中的蛋白表达水平差异明显，不同受试药物作用的结果也相对明显。本研究表明，对于多药耐药相关酶PCK、GST-π及TopoⅡ，索拉非尼和高剂量的美洲大蠊多肽PAE2的下调作用相对较优；同样，研究结果也反映出上述参与细胞运转代谢的酶，对于HCC细胞产生多药耐药性可能只是存在调节，并不一定具有主导作用，在后续的研究中，需要系统深入地对酶介导的多药耐药性作用进行进一步分析，未来仍需进一步寻找上游的调控靶点，才能更好地为美洲大蠊多肽PAE2的临床前研究、临床应用和产业化提供强有力的依据。