载荷利福平和异烟肼的BCP人工骨在家兔体内释药性能初步研究

李忠杰，刘飞飞，阮玉山，丁 凯，雷延发，和 英，李绍波*

（1. 大理大学第一附属医院脊柱外科，云南大理 671000；2. 大理大学临床医学院，云南大理671000；3. 大理大学药学院，云南大理 671000）

结核病由来已久，骨关节结核是常见的肺外结核。临床对骨关节结核常用病灶清除术，但术后会遗留较大的结核性骨缺损〔1〕，需要植骨重建，如有一种既能起到结构性支撑，又能缓慢释放高浓度一线抗结核药物的植骨材料，则对局部高效杀灭结核分枝杆菌十分有利，对于骨关节结核局部的稳定性重建与快速治愈病灶具有重要意义。双相磷酸钙（bidirectional calcium phosphate, BCP）人工骨是由羟基磷灰石（HA）和β-磷酸三钙（β-TCP）依照不同比例组合而成，具有生物兼容性、生物活性及骨传导性等特质，可提供骨组织生长架构及引导新生骨组织生长。因此，本研究将制备吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨，检测BCP人工骨的载药率，观察其在家兔体内的释药性能。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备及实验动物BCP人工骨（BCG01，2~3 mm，60% HA+40%β-TCP，台湾微创医疗器械股份有限公司），利福平（RFP，上海罗恩试剂），异烟肼（INH，上海罗恩试剂），TU1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），成年雄性健康新西兰大白兔24只（体质量2.5~3.0 kg，普通级，大理大学动物实验中心提供）。

1.2 制备吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨避光条件下配制50 mg/mL异烟肼药液（500 mg溶于10 mL去离子水），准确称量1 g BCP人工骨颗粒浸泡于异烟肼药液中，超声震荡仪适度震荡，以人工骨颗粒表面无气泡逸出为宜，取出后冷冻干燥制得吸附异烟肼的BCP人工骨备用。避光条件下配制10 mg/mL利福平药液（100 mg溶解于10 mL甲醇），将上述已干燥吸附异烟肼的BCP人工骨浸泡于利福平药液中，同样用超声震荡仪适度震荡，取出在避光条件下待甲醇挥发后制得吸附异烟肼和利福平的BCP人工骨，辐照灭菌后低温避光保存备用。

1.3 吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨载药量的测定①紫外-可见分光光度计定量测定并绘制利福平在甲醇中的标准曲线。②用直接测定法测定载药率：称取100 mg载药BCP人工骨浸入1.5 mL甲醇中，用匀浆机研碎，使利福平充分溶于甲醇后离心10 min（6 000 r/min）得到含利福平的上清液。称取同等质量的无药BCP人工骨，通过与上述相同的处理过程，得到参比上清液，含利福平的上清液稀释至合适浓度后用紫外-可见分光光度计测定波长为474 nm处的吸光度，载药BCP人工骨样品中利福平的浓度通过标准曲线计算得到。载药率%（利福平）=［M（利福平质量）/M（人工骨质量）］×100%。异烟肼载药率测定方法与利福平相同，测量波长调整为263 nm。按照“1.2”项下方法制备载药BCP人工骨3份，并按“1.3”项方法测定载药量，得到人工骨的平均载药率。

1.4 制备家兔髂骨骨缺损模型与人工骨植入所有家兔术前均禁食禁水12 h，随机分为两组，空白组（BCP人工骨组）6只、实验组18只（载荷利福平、异烟肼BCP人工骨组），用3%戊巴比妥钠（1.3 mL/kg）静脉麻醉，俯卧位固定，髂嵴手术区备皮，消毒铺巾后作一长约2 cm切口，暴露髂骨，咬除15 mm×10 mm骨质，建立髂骨骨缺损模型，空白组直接缝合，实验组在骨缺损内将分装保存的载药人工骨植入，将缺损周围肌层严密缝合以固定人工骨。所有家兔术后均分笼饲养，自行摄食及饮水，常规换药及拆线。

1.5 吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨在体内的药物释放行为

1.5.1 取材 在吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨植入后的第1、3、7、14、28、56天分别将空白组1只和实验组3只家兔麻醉，取下腔静脉血置入柠檬酸钠抗凝管，离心20 min（3 000 r/min）将血浆标本于-80℃保存待测；同时按原手术切口进入，取髂骨骨缺损部位及周围约5 mm包括松质骨、肌肉组织及植骨材料标本于-80℃保存待测。

1.5.2 血浆样品药物浓度测定 绘制药物在血浆中的标准曲线，采用紫外-可见分光光度计分别测量263、474 nm处的吸光度值，计算载药上清液中利福平及异烟肼的浓度，得到血浆中药物浓度。

1.5.3 局部组织药物浓度的测定 将取出的组织块剪碎称重取500 mg，加入1.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）匀浆后量取1mL，加入2mL甲醇使蛋白质沉淀后离心20 min（6 000 r/min）保留上清液待测，以空白组为参比，采用紫外-可见分光光度计分别测量263、474 nm处的吸光度值并计算载药上清液中利福平及异烟肼的浓度，得到局部组织药物浓度。

1.6 统计学分析所有测量指标均以表示，釆用SPSS 23.0统计学软件，对同一时间点血浆药物浓度和局部组织药物浓度用Nemenyi法两两样本之间进行比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨的载药率

2.1.1 利福平载药率 利福平甲醇溶液标准曲线方程为：A= 0.037 1C+ 0.004 2，R2= 0.998 4，利福平在5.0~50.0 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。3次制得的载药BCP人工骨取样100 mg，测得样品中的药物量分别为5.13、6.72、6.08 mg；计算其利福平载药率分别为5.13%、6.72%、6.08%，最终算得的载药率为（5.98±0.80）%。

2.1.2 异烟肼载药率 异烟肼PBS溶液标准曲线方程为：A= 0.029 2C+0.033，R2=0.997 8，异烟肼在5.0~50.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。3次制得的载药BCP人工骨取样100 mg，测得样品中的药物量分别为15.48、12.69、17.08 mg；计算其异烟肼载药率分别为15.48%、12.69%、17.08%，最终算得的载药率为（15.08±2.22）% 。

2.2 吸附利福平和异烟肼的BCP人工骨在体内的药物释放行为利福平血浆上清液中的标准曲线方程为：A= 0.069 4C+0.006 3，R2=0.997 5，利福平在5.0~25.0 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。异烟肼血浆上清液中的标准曲线方程为：A= 0.031 6C+0.026 9 ，R2=0.998 2 ，异烟肼在5.0~50.0 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。不同时间点利福平和异烟肼在血浆和局部组织中药物浓度情况见表1。

表1 植入载药BCP人工骨后在不同时间点的利福平和异烟肼血浆和局部组织药物浓度（，n=3）

表1 植入载药BCP人工骨后在不同时间点的利福平和异烟肼血浆和局部组织药物浓度（，n=3）

注：“—”代表药物浓度未检出；Nemenyi法两两样本之间比较，*P <0.05。

时间/d利福平 异烟肼血浆药物浓度/（μg/mL） 局部组织药物浓度/（μg/mL） 血浆药物浓度/（μg/mL） 局部组织药物浓度/（μg/mL）1 12.22 ± 0.71 91.01 ± 8.99* 16.59 ± 0.38 107.17 ± 6.42*3 14.92 ± 1.41 105.56 ± 5.84* 19.73 ± 1.01 126.86 ± 5.44*7 8.46 ± 0.63 89.50 ± 5.11* 6.10 ± 0.17 62.66 ± 7.07*14 5.61 ± 0.45 47.93 ± 4.51* 5.31 ± 0.11 13.94 ± 1.99*28 5.04 ± 0.70 11.34 ± 1.84* — 5.23 ± 0.91*56 — 6.28 ± 0.59* — —

3 讨论

药物治疗在骨关节结核治疗中起着关键的作用，目前抗结核相关研究主要集中在以异烟肼、利福平为代表的一线抗结核药物。异烟肼为类白色的结晶，易溶于水，对处于快速繁殖期的结核分枝杆菌有较好的杀灭作用，而对缓慢生长或静止期结核分枝杆菌仅能起到一定的抑制作用，对细胞内及细胞外的结核分枝杆菌都具有杀灭作用，异烟肼的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为 0.025 ~0.050 μg/mL〔2-3〕，最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）为10倍的MIC。利福平为红色至橙色粉末，易溶于甲醇而在水中几乎不溶，利福平对静止期及繁殖期的结核分枝杆菌均能杀灭，也被用于耐药性结核的治疗，研究表明〔4-5〕在液体培养基中的MIC为0.006~0.050 μg/mL，其MBC为0.005~0.200 μg/mL。为预防耐药结核的出现，以及增强抗结核疗效，通常选择联合用药，考虑骨关节结核治疗中异烟肼、利福平作为最常用的两种一线药物，本实验选择担载异烟肼、利福平。

载药人工骨修复材料直接接触病变部位，在植入后缓慢降解并释放药物而被认为是局部治疗理想的载体〔6〕。磷酸钙因其具有整合和保留活性物质的能力，而且随着时间的推移会逐渐降解，从而被新形成的骨所取代，常被用作治疗骨疾病的药物载体，载药磷酸钙释药可以按照两种主要机制进行：通过磷酸钙载体的多孔网络扩散以及进行性的生物降解。载药支架特性（即微观结构、孔隙率、比表面积等）以及载药剂量参与了释放动力学和释放剂量的控制〔7〕。BCP为较常用的磷酸钙材料，采用羟基磷灰石和β-磷酸三钙按不同钙磷比制备而成，BCP人工骨具有较高的孔隙率且溶解度介于羟基磷灰石和β-磷酸三钙之间，可以吸附药物且提供骨组织生长架构，因此，我们选择BCP人工骨作为药物载体。

作为对载药人工骨缓释实验的初步研究，我们选择较为简单易行的负载方法，将利福平及异烟肼溶液直接浸泡然后干燥，使药物吸附于BCP人工骨内，植入体内后通过扩散的方式及逐渐溶解释放药物。我们参考文献〔8〕，通过紫外-可见分光光度法分别测量并计算BCP人工骨对两种药物的载药率，结果显示：异烟肼载药率大于利福平载药率，这与我们配制两种药物溶液浓度有关系，实验结果表明两种药物均能够扩散至周围组织及血液中，且两种药物同一时间局部组织的药物浓度高于血浆药物浓度，检测到的浓度均大于两种药物的有效治疗浓度。两种药物在初期均有突释现象，且异烟肼较利福平明显，两者在释放初期也表现出差异，无论是在血浆还是局部组织中，我们均能看到利福平较异烟肼有更长的释放，术后56 d仍能检测到局部组织中有利福平，而异烟肼未检测到，术后28 d在血浆中检测到利福平而未检测出异烟肼，这可能还与我们选择的检测方法有关，文献〔9〕报道的高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱联用法等方法可检测多种药物且方法简便、快速，灵敏度和准确度高，但检测成本较高，仪器普及率较低，临床上难以推广运用。

本实验结果中，药物载药率及释放时间较文献〔10〕报道偏低，因为我们选择将利福平及异烟肼溶液直接浸泡吸附于BCP人工骨内，缓释具有局限性。将药物与聚合物微球相结合可以提高药物缓释性能，何胤等〔11〕报道了载异烟肼、利福平、吡嗪酰胺的聚乳酸-羟基乙酸缓释微球具有平稳缓慢释放的特性，植入体内可实现局部给药和缓释长程治疗的双重效果，且实现了多药的负载。Roth等〔12〕研究证实了与胶原复合的磷酸钙显示出明显更高的负载能力和稳定释放能力。目前很多研究利用3D打印技术可以制备出具有结构复杂的载药人工骨支架，伍卫刚等〔13〕利用3D打印技术制备的利福平-异烟肼-控释型载药人工骨可以实现药物的联合治疗，利福平及异烟肼两种药物可依次序贯释放，实现了药物的控释和缓释目的。因此本实验虽然证实了吸附异烟肼和利福平的BCP人工骨具有一定的缓释性能，但载药方式有待改进，与满足临床骨关节结核局部抗结核治疗所需的优越性能仍有差距，也是我们日后进一步优化改善的方向。本实验表明载荷利福平和异烟肼的BCP人工骨植入髂骨骨缺损模型具有抗结核药物缓释效果，术后持续一定时间能达到局部有效抗菌浓度，能作为后续抗结核药物缓释相关研究的载体。