基于网络药理学的冬虫夏草治疗肝硬化作用机制研究

李 捷，陈依春，李举发，陈临涛，王嘉喆，姜伊娜，张斌涛

（1.西藏民族大学医学院，陕西咸阳 712082；2.陕西中医药大学基础医学院，陕西咸阳 712046；3.咸阳市中心医院麻醉手术部，陕西咸阳 712000）

肝硬化是一种或多种慢性肝病长期反复发展,导致肝脏炎症、持续纤维化、假小叶、再生结节以及血管增殖为主要病理特征，并且持续恶化而形成的一种疾病〔1-2〕，该病早期需及时有效地控制，否则容易引发肝腹水和肝癌，严重者将威胁患者生命〔3〕。

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）又称“虫草”，生于虫草蝙蝠蛾等的幼虫体上，主要分布于我国西藏、青海、四川、云南、甘肃等海拔4 000 m以上的高山灌丛和高寒草甸等地，是我国重要的名贵药材之一。有研究显示，冬虫夏草对肝纤维化、肝硬化等不同程度肝损伤具有明确的治疗作用，但其治疗肝硬化具体的物质基础和作用机制尚不明确〔4-5〕。

网络药理学是在计算机网络迅速发展的背景下，基于系统生物学理论，对药物多成分作用靶点以及疾病靶点间相互关系构建药物-靶点-疾病网络，进行系统的网络分析，进而对药物作用的机制和物质基础进行预测的一种现代化研究手段〔6-7〕。本研究运用该方法筛选冬虫夏草治疗肝硬化作用靶点及活性成分，建立成分-靶点网络、蛋白相互作用网络（PPI），分析冬虫夏草治疗肝硬化的作用机制和相关物质基础。

1 方法

1.1 数据建立在TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“冬虫夏草”为关键词，检索该药物的化学成分，以类药性（DL）≥0.14，口服生物利用度（OB）≥30%为筛选条件，通过筛选，收集化学成分及对应靶点信息。将查找条件设置为“Homo Sapiens”“Reviewed”靶基因，利用Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）进行规范化处理；将疾病靶点查找条件设置为“liver cirrhosis”，通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org）进行检索。

1.2 网络的构建利用上述各检索结果，将所得疾病与成分间靶点进行映射，获取冬虫夏草治疗肝硬化作用靶点，通过Cytoscape 3.2.1软件构建成分-靶点相关网络。为进一步获取关键靶点，将筛选出的交集蛋白信息输入STRING数据库，蛋白相互作用信息选取置信度≥0.9，并剔除游离点，将筛选数据导入Cytoscape 3.2.1软件，通过计算汇总，构建PPI。

1.3 GO功能和KEGG通路富集分析本研究通过DAVID 6.8数据库对靶蛋白进行GO功能和KEGG通路富集分析，在PPI网络中说明靶蛋白在通路和基因功能中的相关作用。

2 结果

2.1 冬虫夏草主要活性成分筛选通过TCMSP数据库筛选出冬虫夏草化学成分共12个，将无靶点成分去除，共得到6个活性成分。见表1。

表1 冬虫夏草活性成分参数

2.2 构建冬虫夏草活性成分治疗肝硬化的成分-靶点网络图进一步对冬虫夏草活性成分进行靶点检索，共获得87个对应靶点，GeneCards数据库获得肝硬化相关的靶点4 350个。二者映射后获得冬虫夏草治疗肝硬化相关靶点56个，分别为HTR2A、ALDH3A1、ALDH2、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、BAX、BCL2、ALOX5、ABCA1、ADRB2、GLB1、CASP3、CASP8、CASP9、CDK4、CETP、F7、F10、COL1A2、C1R、PLA2G4A、DRD1、CCND1、GABRA1、GABRA2、GABRA6、G6PD、IGHG1、UCP2、MAPK1、PRKACA、ABCC4、CHRM3、OPRM1、NOS2、PPARG、PTEN、PIK3CG、PECAM1、EGF、PGR、PTGS1、PTGS2、PRKCA、SELP、RXRA、RXRB、PON1、SLC6A3、SLC6A4、JUN、TGFB1、TRPM5、TNFRSF1A和TNFRSF1B。

2.3 成分-靶点网络构建将冬虫夏草治疗肝硬化的56个靶点数据及6个活性成分导入Cytoscape 3.2.1软件，构建成分-靶点网络图，图中清晰直观地呈现疾病靶点与药物成分之间的网络关系，其中，深色圆圈代表化合物，浅色圆圈代表靶点。见图1。

图1 冬虫夏草治疗肝硬化的成分-靶点网络图

2.4 成分-靶点网络拓扑结构分析成分-靶点网络分析结果显示，图中可见62个节点，形成82个关系对。“自由度”代表图中某一节点直接作用的节点数，值的大小说明该节点在网络中的重要性。本研究中，成分-靶点网络平均自由度为2.65，这表明冬虫夏草成分中存在成分与靶点间相互作用的情况。成分-靶点网络拓扑结果分析显示，6个活性成分的靶点数在均值以上，其中自由度≥11 的活性成分共3个，分别是花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇，由此表明，这些活性成分均能通过作用于多个靶点而对疾病产生治疗作用；自由度≥3 的靶点有 RXRA、PTGS2、PTGS1 ，存在于多个活性成分中，这说明冬虫夏草成分-靶点间存在着复杂的作用关系。见表2。

表2 网络拓扑分析

2.5 PPI的构建与分析将STRING数据库分析结果，导入 Cytospase 3.2.1软件，可得到由45个靶点组成的59个蛋白相互作用关系图。同时根据节点的“自由度”设置颜色，颜色越深代表“自由度”越大。结果表明，关键蛋白涉及MAPK1、RXRA、CASP8、RXRB、PPARG、BCL2、JUN、PRKCA等，即药物治疗肝硬化，通过这些关键蛋白与多个蛋白的相互作用，从而达到治疗效果。见图2。

图2 相关靶点PPI图

2.6 GO 功能富集分析GO 功能富集分析是通过生物过程、分子功能和细胞组成对基因进行富集分析，共得到23个条目（FDR<0.01）。见表3。生物过程主要包括药物反应，雌二醇反应、脂多糖反应以及老化过程的调节；细胞组成主要影响细胞膜、细胞质等；分子功能主要涉及蛋白同源二聚化、酶结合和药物结合。根据FDR值由小至大排序，列出前20个GO功能条目。见图3。

图3 PPI网络中靶点的GO富集情况图（FDR排名前20）

表3 PPI网络中靶点的GO功能条目（FDR < 0.01）

2.7 KEGG通路富集分析本研究通过DAVID 6.8数据库，对56个靶点进行KEGG通路富集分析，来分析冬虫夏草治疗肝硬化相关靶点在信号通路中的作用，共得到44条信号通路（P< 0.01），按照FDR由小到大排列，见表4。其中10条直接与肝硬化相关，分别是含血清素的神经突触、细胞凋亡、p53信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、黏着斑激酶、MAPK信号通路、FoxO信号通路及HIF-1信号通路等 。采用E Chart（http://www.ehbio.com/ImageGP/）对通路富集情况进行可视化处理，结果见图4。

图4 KEGG通路富集分析

表4 冬虫夏草治疗肝硬化相关通路（P < 0.01）

3 讨论

肝硬化是肝脏疾病长期持续受损的一种终末临床期表现，在非传染性疾病中，晚期肝硬化已成为威胁生命的重要疾病〔8〕。目前治疗肝硬化临床常用药物主要有抗病毒保肝类药物、保钾排钾利尿类药物等〔9-11〕，这些药物只能在一定程度上缓解肝功能失代偿，但副作用较大，因此开发有效治疗肝硬化药物迫在眉睫。本研究结合网络药理学对特色藏药冬虫夏草治疗肝硬化的有效成分及作用靶点进行初步分析，以期为临床研究提供思路。

本研究从网络药理学思路出发，通过在线数据库共筛选出6个活性成分，其中，花生四烯酸、十八烯酸、β-谷甾醇等是冬虫夏草发挥药效的主要成分。花生四烯酸是一种不饱和脂肪酸，也是人体内主要的脂肪酸，具有抗炎和提高免疫的作用〔12〕。十八烯酸为不饱和脂肪酸，分离于猫儿眼块茎中，具有抑制肿瘤生长的作用〔13〕。β-谷甾醇是几种广泛研究的植物甾醇类之一，具有降低血清胆固醇代谢作用〔14〕。有研究发现，β-谷甾醇可通过诱导肿瘤细胞凋亡，从而显著降低细胞活力〔15〕。这些成分可能是肝细胞生长因子抵御肿瘤侵袭抗肝癌作用的主要成分〔16〕,从而有效降低肝硬化向肝癌的转变概率。结合成分靶点、疾病靶点相关数据库，筛选出56个药物治疗肝硬化的相关靶点，包括PTGS1、PTGS2、RXRA、ADRB2等主要靶点，其中PTGS1和PTGS2即环氧合酶1（COX1）和环氧合酶2（COX2），它们在炎症反应中发挥着重要作用。PPI网络拓扑分析表明，MAPK1、RXRA是冬虫夏草治疗肝硬化的潜在靶蛋白，这些靶蛋白主要参与炎症反应、细胞周期及信号传导等过程〔17〕。

GO功能分析表明，冬虫夏草治疗肝硬化相关靶点主要富集在药物反应、脂多糖反应、血管生成、酶结合、细胞增殖正调控等过程。KEGG通路富集表明，这些靶点直接与肝病相关的通路有乙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病等。同时还与炎症相关通路，如PI3K-Akt、MAPK、肿瘤坏死因子、HIF-1、FoxO、VEGF等信号通路相关联，从而影响肝硬化的发生发展。

冬虫夏草治疗肝硬化的成分-靶点网络以及GO、KEGG富集分析表明冬虫夏草有效成分作用于多个靶点，主要通过影响多个生物过程以及信号通路间相互作用，从而起到治疗肝硬化的作用。