细胞治疗产品非临床活体示踪方法研究进展

王舒哲，许波华，王 雁，黄芳华，邱云良

（1.上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620；2.中国医药工业研究总院上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203；3.益诺思生物技术南通有限公司，江苏 南通 226133；4.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022）

细胞治疗是指利用患者自体（或异体）的成体细胞或干细胞对组织、器官进行修复的治疗方法，主要用于恶性肿瘤、骨髓移植、晚期股骨头坏死、心肌梗死和脑损伤等疾病的临床研究和治疗。目前临床试验中使用的主要是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、T淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）和造血干细胞，对树突细胞（dendritic cells，DC）、巨噬细胞、肝细胞和上皮细胞以及其他细胞的研究较少［1-2］。2009年12月，美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准人异体骨髓MSC产品（Prochymal）上市，这是世界上第1个干细胞产品。随后，澳大利亚、加拿大、韩国、意大利、新西兰和日本等陆续批准干细胞产品上市或应用。2017年下半年，美国FDA批准了2个嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）产品Kymriah和Yescarta上市。2020年7月，美国FDA再次批准了一项新的CAR-T细胞疗法产品Tecartus，这是美国FDA批准的首个基于细胞的基因疗法［3］。

细胞疗法作为肿瘤学研究和临床实践中的新型疗法，受到相当多的关注，在多种疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。但其治疗疾病的机制和细胞移植后在宿主体内的分布和迁移尚不明确。细胞治疗产品研究与评价技术指导原则指出，细胞治疗产品的药动学研究内容应包括细胞的分布、迁移、归巢和分化。应采用一种或多种合适的细胞追踪方法评价细胞产品的分布、迁移、归巢及其存续和消亡特征。可选择的技术方法有活体影像技术、聚合酶链式反应（PCR）技术和免疫组化技术等，其中免疫组化学技术是传统的组织分布研究技术，虽已较为成熟，但需在细胞移植后处死动物，取出相应组织进行检测，存在一定局限性。非临床和临床的活体影像示踪技术的应用，可实现无创性实时监测移植细胞在宿主体内的迁移、分布和存留等，从而有助于开展细胞治疗技术的深入研究和应用［4-6］。研究表明，结合多种无创性成像技术的细胞标记方法（直接标记或报告基因转染的间接标记）可实时追踪体内标记的细胞，监测细胞的迁移、分布以及量化细胞的蓄积和功能。近年来，已有大量关于细胞在非临床无创性示踪方法的研究。本综述主要对细胞非临床活体示踪方法的研究进展进行总结，从而为细胞治疗产品的组织分布、迁移和功能研究提供参考。

1 细胞标记及活体示踪技术

为实现对移植细胞的无创示踪，首先需要以一种能可视化的方式对细胞进行标记。细胞的标记及活体示踪技术在细胞移植研究中起着非常重要的作用，目前常用的细胞标记及示踪方法众多，主要分为两大类，即直接细胞标记法和间接细胞标记法。直接标记法是在细胞体外培养时应用放射性核素、磁性物质、荧光染料等显像剂直接标记细胞，然后采用正电子发射计算机断层成像（positron emission tomography，PET）、单光子发射计算机断层成像（single photon emission computed tomography，SPECT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和光学成像等手段进行成像。这些显像剂通过与细胞表面蛋白结合或被动扩散进入细胞内，与胞内的蛋白质结合，从而产生稳定的标记，然后再移植到宿主体内。这种方法不需要对细胞进行其他修饰，操作简单。

另一种为间接标记方法，通常依赖于一个报告基因，通过外源报告基因的稳定或瞬时表达将报告基因转染到细胞中，整合的报告基因在活细胞中转录和翻译，并最终转化为功能酶、受体或光学活性蛋白。然后表达的产物可被可成像的显像剂靶向结合并与合适的底物相互作用产生信号，再采用荧光成像（fluorescence imaging，FLI）、生物发光成像（bioluminescent imaging，BLI）和核素成像等不同的成像方式捕获该信号［7］。此时，报告基因表达的产物结合显像剂后成像，而不是报告基因本身被成像。因此是一种间接标记的方法。目前，最常用的报告基因有萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，Fluc）基因、单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase，HSV1-tk）基因、Luc-2基因和碘化钠同向转运体（sodium iodide symporter，NIS）等。每种方法各有其优缺点，选择的标记方法应具有特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、标记和检测方法简单易行等特点。本文主要综述近年来常用的细胞非临床活体成像方法及其在细胞治疗研究中的应用。

2 细胞非临床活体成像方法及应用

2.1 核素成像

2.1.1 直接标记

放射性核素用于在细胞移植前进行体外标记，可检测到pmol甚至更低浓度的放射性标记，同时实现对位置较深的器官的可视化。因此，放射性核素成像方式通常优选用于体内细胞追踪。常见的放射性核素有99mTc（半衰期6.08 h）、111In（半衰期2.8 d）、18F（半衰期110 min）、64Cu（半衰期12 h）和89Zr（半衰期3.27 d）等。根据其物理半衰期不同，可使用成像工具在数小时至数天内跟踪这些同位素标记的细胞。可根据实际所需观察的时间决定采用哪种放射性核素。89Zr具有较长的半衰期［8］，可通过PET成像对其标记的细胞进行长期监测（表1）。Weist等［9］使用89Zr-oxine标记CAR-T细胞。PET成像结果表明，89Zr-oxine可用于CAR-T细胞的标记和显像，同时可保持细胞活力和功能，提示89Zr-oxine用于实时追踪CAR-T细胞具可行性。Liu等［10］和Asiedu 等［11］分别使用89Zr-oxine 标记内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）和骨髓细胞。PET/CT成像结果显示，89Zr-oxine可有效标记和追踪EPC及骨髓细胞，可用于临床实践中细胞移植的无创监测。还有研究用89Zr-oxine标记EL4小鼠淋巴瘤细胞、DC、细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和NK细胞，通过PET/CT活体成像证明，89Zr-oxine适用于标记多种不同类型的细胞［12］。89Zr还可以和p-NCs-B2-DFO螯合形成89Zr-DBN复合物，通过与细胞膜表面蛋白的伯胺基团共价结合标记细胞。Bansal等［13］用小鼠黑素瘤细胞、人骨髓MSC和小鼠DC评估89Zr-DBN标记细胞的方法，表明89Zr-DBN是一种生物稳定的基于PET活体成像的细胞标记方法。他们随后还通过PET成像在缺血性心衰小鼠模型中评估89Zr-DBN标记对人心脏造血干细胞的功能（细胞增殖能力、细胞活力、细胞凋亡和放射性流出率等）和治疗效果的影响。结果表明，心脏造血干细胞在89Zr-DBN标记后，很好地保留了细胞特性和治疗潜力［14］。还有一些研究报道了其他放射性核素标记MSC的可行性，分别用18F-FEAU，131I-FIAU和99mTc-HMPAO标记细胞，然后使用PET成像技术监测细胞［15-16］（表2）。还有研究表明，111In标记MSC后SPECT成像时 MSC 的体内监测可长达 10～14 d［17］。用111In-oxine标记离体扩增的NK细胞，并将其注射到结肠癌患者的肝动脉中，SPECT观察到NK细胞在恶性病变中蓄积，该研究的局限性在于111In标记NK细胞的标记效率较低（＜60%）［18］（表1）。后来Charoenphun等［19］分别用89Zr-oxine和111In-oxine对3种不同细胞系和人白细胞进行标记，监测其标记效率和流出率，发现89Zr在体外细胞中的保留率明显优于111In。89Zr-oxine为体内细胞追踪的长半衰期PET示踪剂的需求提供了一种潜在的解决方案。直接标记方法可以很好地观察到细胞在体内的分布及迁移，但显像剂会随细胞的代谢和分裂逐渐稀释或流出，成像时间短，不能用于长期追踪细胞，且此种方法所使用的显像剂在过高浓度下会引起细胞毒性。

表1 非临床成像技术直接细胞标记示踪方法

表2 非临床成像技术间接细胞标记示踪方法

2.1.2 间接标记

目前，已有研究开发了多种基于细胞PET成像的报告基因，如HSV1-tk、人去甲肾上腺素转运体（human norepinephrine transporter）和前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen）［20-23］。然而，由于免疫原性以及在肿瘤部位的背景摄取等因素，只有HSV1-tk在临床上得到了应用。HSV1-tk报告基因可通过磷酸化18F-FHBG〔9-（4-［18F］Fluoro-3-hydroxymethylbutyl） guanine〕产生高能量光子，可用PET检测。为研究人MSC对微观肿瘤自杀基因及细胞因子的治疗效果，Huang等［24］在MSC中导入HSV1-tK基因，再注射于荷瘤裸小鼠体内。PET成像结果显示，18F-FHBG标记的MSC趋向肿瘤组织并大量增殖。研究报道，将导入Luc-2报告基因的人MSC（MSC-luc2）iv给予人乳腺癌荷瘤小鼠，从给药5 h后可持续成像8周。BLI显示，MSC-luc2迁移到小鼠乳腺癌的肺转移组织中，且信号集中在转移瘤上，成功地显示了MSC向肺转移的归巢［25］。有研究报道，在动物乳腺癌模型中，iv给予或肿瘤内注射表达碘化钠同向转 运体（sodium iodidesymporter，NIS）的 MSC（NIS-MSC），然后使用SPECT对99mTc进行成像，成功获得了NIS-MSC在移植动物体内的分布图像［26］。也有研究通过124I-PET成像研究了iv给予NIS-MSC在肝癌小鼠体内的分布，72 h后观察到NIS-MSC在肿瘤中募集［27］。将NIS-MSC注射到携胰腺肿瘤模型小鼠中，124I-PET成像结果显示，124I在小鼠肿瘤中有明显的蓄积，表明NIS-MSC迁移至肿瘤［28］（表2）。与直接标记方法相比，报告基因转染的间接标记方法能进行体内移植细胞的长期示踪。但缺点是报告基因转染的稳定性差，表达不稳定，插入后可能会导致细胞发生突变甚至形成肿瘤。有些报告基因（如HSV1-tk）作为一种病毒蛋白，具有免疫原性，是宿主免疫系统的作用靶点，会导致报告基因的敏感性降低。

2.2 核磁共振成像

20世纪80年代中期，氧化铁纳米颗粒作为诊断成像的造影剂被开发出来。过去20年中，已建立了用超顺磁性氧化铁（super paramagnetic iron oxide，SPIO）标记细胞的方法辅助细胞疗法的靶向递送和追踪。SPIO是一种磁性离子，能产生较强的T2负性对比效应，用SPIO标记干细胞后，可通过MRI研究干细胞在体内的分布与迁移（表1），已成功用于SPIO标记神经干细胞的示踪［29］。将SPIO标记骨髓来源的DC iv给予C57BL/6雄性小鼠后，通过MRI对小鼠无创示踪，量化了体内DC的迁移特征［30］。SPIO标记的人脐带MSC在移植后可在宿主脊髓中存活和迁移，从而促进脊髓损伤的恢复，表明SPIO标记的人脐带MSC移植后的无创性成像是可行的［31］。另有研究对SPIO标记的大鼠MSC进行成像，发现细胞可在术后4～8周促进腱-骨愈合［32］。在肝纤维化大鼠模型中，用SPIO标记骨髓来源MSC，MRI信号在移植后15 d仍可检测到［33］。在脑损伤模型大鼠中，通过SPIO标记和MRI可见，MSC在病变部位停留时间超过30 d［34］。在宫颈癌模型小鼠中，iv给予SPIO直接标记的MSC，通过MRI观察到标记的MSC在肿瘤部位蓄积［35］。还有研究用SPIO标记内皮细胞，通过MRI成功检测并表征了内皮细胞炎症，为检测动脉粥样硬化中的血管炎症提供了潜在方法［36］。SPIO虽可很好应用于MSC移植后的示踪成像，但其不能长时间停留在标记细胞中，可能会被巨噬细胞吞噬，从而导致MRI显示结果不准确。所以，基于SPIO标记的MRI不适合在体内长期示踪移植的MSC［37］。

2.3 光学成像

2.3.1 直接标记

目前使用的荧光染料包括有机染料和无机染料。使用最广泛的有机染料是一系列明亮的亲脂性膜染料，易嵌入生物质膜内做侧向扩散运动，从而标记细胞膜，有发出红色荧光的DiI、远红外的DiD和近红外发射的DiR。这些示踪染料对干细胞的归巢和迁移的影响极小，可在移植后监测细胞24～48 h［38］。Wennerberg等［39］在人类黑素瘤模型小鼠中，iv给予亲脂性染料DiR标记的NK细胞。荧光成像显示，DiR标记的NK细胞迁移至黑素瘤部位。Tavri等［40］用另一种亲脂性染料DiD标记NK细胞，荧光成像显示小鼠iv给予NK细胞90 min后，NK细胞向表达人前列腺癌细胞相关上皮细胞黏附分子的肿瘤迁移。24 h后，有更多NK细胞迁移到肿瘤。有研究者用近红外荧光团IR-786标记MSC，并将其注射到心肌梗死模型猪中，注射后90 min成功检测到MSC［41］。常用的其他有机染料包括吲哚菁绿、Cy5.5和PKH26等。Flexman等［42］成功用SPIO和PKH26联合标记胚胎神经干细胞，将其移植到大鼠脑内，可以定量和定性地跟踪移植后的胚胎神经干细胞在脑内的迁移。无机染料一般指无机量子点（quantum dots，QD），在激发时会产生一系列不同的波长，从而发出荧光。QD标记细胞的优点包括高灵敏度和优良的分辨率［43］。有文献报道，QD可以通过被动孵育或者靶向肽介导来标记和监测MSC，研究者将QD与Q tracker标记试剂盒一起使用，通过体外模型研究，发现QD具有生物相容性，并且成功地将带有QD标记的MSC成功地应用到共培养系统中［44］（表1）。

2.3.2 间接标记

通过光学成像技术检测荧光蛋白的表达是长期追踪干细胞移植的有力工具，如Fluc可催化荧光素产生低能量光子（2～3 ev），这些电子可以被Fluc成像系统或采用生物发光成像系统的电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相机捕获并成像。当Fluc与底物D-荧光素相互作用时会发光，该光学信号可被BLI的感光设备捕获。Zhu等［45］将Fluc2基因转导至NK细胞，并用BLI技术追踪其在具有肺转移或异种移植甲状腺癌的模型小鼠中的迁移。成像结果显示，NK-Fluc2细胞在1 h内迁移并浸润到肺肿瘤中，并停留长达24 h，在48 h时数量减少。最近的一项研究结果表明，携人甲状腺癌或人乳腺癌小鼠iv给予Fluc2基因转导的人MSC，使用BLI观察到MSC-Fluc2迁移至甲状腺和乳腺癌部位［46］（表2）。

生物发光技术虽已取得较大进步，但荧光蛋白的激发和发射波长较短，组织穿透能力有限，灵敏度不高，且很多报告基因表达不很稳定，可能会导致突变发生，甚至形成肿瘤。这种缺陷可选用荧光染料对干细胞进行直接染色来克服。然而，这种通过光学成像检测的荧光标记方法很大程度上限于组织表面以下几百微米，不适用于临床深层组织成像。为检测到更深的组织部位，可使用放射性核素标记方法，灵敏度高且不受深度限制［47］。

3 结语

细胞疗法可分为基因修饰疗法和非基因修饰疗法，前者需要利用基因工程提高细胞疗效，如基因修饰的CAR-T细胞等；后者则不需要利用基因工程技术，包括所有目前批准的干细胞疗法和肿瘤浸润淋巴细胞疗法。对于非基因修饰的细胞体内追踪，直接和间接标记之间的选择取决于研究问题的精准性和实用性，当然还取决于是否需要进行临床的长期追踪以及研究目的。通过报告基因转染细胞的间接标记方法，在长期追踪细胞方面明显优于直接标记，因为它避免了直接标记过程中复杂的剂量学问题（标记物流出、标记物稀释和观察时间有限等）。但是，尽管直接标记方法本身具有明显的缺点，它仍然是目前细胞活体成像领域非常有力的工具。据报道，通过开发新一代全身PET/CT扫描仪可能会改善这种缺点。新一代扫描仪增加了覆盖整个身体的几何覆盖率，可以将全身成像的灵敏度提高约40倍，或将单个器官成像的灵敏度提高4～5倍［48］。未来使用全身PET/CT扫描仪进行的体内细胞示踪研究将开发出更安全、更灵敏、半衰期更长的显像剂，从而在一定程度上延长细胞的追踪时间。多模式核成像技术（如PET/CT，SPECT/CT或PET/MRI）由于其高灵敏度且能提供精细的解剖学信息的能力，将成为未来评估体内治疗性细胞的有力工具。在Clinicaltrials.gov网站上，以“细胞治疗”作为关键词进行临床试验的搜索，截止2021年6月1日，全球范围内有多达8830项研究正在进行，以探索不同细胞治疗不同疾病的潜力。无创性成像技术的最新研究进展已将细胞治疗领域提升到一个新的水平。通过无创性细胞示踪技术，可对细胞治疗发展的几个关键领域进行定量评估：①治疗细胞随时间在全身的分布；②治疗细胞在治疗过程中是否迁移到移植部位；③是否发生靶向非目标组织效应；④治疗细胞在宿主体内的存活时间。值得注意的是，细胞示踪是基于同一受试者的重复成像。因此，与需要在不同时间点牺牲动物群的传统方法相比，该技术通过减少受试者间的差异提供了更好的统计数据。细胞治疗给予我们开发针对癌症等多种疾病的安全干预策略以新希望，与无创性成像技术结合，有助于了解到更多关于细胞信息以及它们治疗疾病的作用机制。