牛蒡子苷对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

李霖枫，陈重华，李天平

（四川大学1.华西药学院，2.临床医学院，3.华西医院，四川 成都 610041）

乳腺癌是全球女性最常见的侵袭性肿瘤，严重威胁女性身心健康。《全球癌症统计报告》［1］显示，2020年全球新增乳腺癌患者约226万，发病率为11.7%，死亡率为30%（68/226）。乳腺癌具有高度分子异质性，其中三阴性乳腺癌以雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2阴性表达为特征，占所有乳腺癌的15%～20%，多发于绝经前女性，癌肿体积大，易发生转移，恶性程度高，预后相对最差［2-4］。由于缺乏有效治疗靶点且对内分泌治疗不敏感，化疗仍是目前针对三阴性乳腺癌唯一有效的全身治疗措施，常以蒽环类、紫杉类和铂类药物为首选方案［5-6］。然而，化疗药物存在明显的不良反应，如心脏毒性、骨髓抑制和神经损伤等，造成很多患者治疗依从性差，生活质量下降；部分患者在治疗过程中出现耐药现象，导致化疗失败［4，7］。据统计，Ⅱ～Ⅳ期三阴性乳腺癌患者5年生存率明显低于其他类型乳腺癌［5］。因此，积极寻找有效、低毒的治疗药物是药物科学家面临的重要任务。

药用植物在药物发现领域占有重要地位，是新化学实体开发的重要资源。临床上约有1/3药物来源于天然产物或其衍生物，如抗癌药紫杉醇和抗疟药青蒿素。牛蒡子苷（arctiin，ARC）是中药牛蒡子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、降血糖、抗肿瘤等药理作用，可用于防治糖尿病肾病［8-9］。研究表明，ARC能有效抑制多种肿瘤细胞生长，如前列腺癌、骨髓瘤、乳腺癌和结肠癌等［10-12］，提示ARC可能是一种潜在的抗肿瘤药物。Lee等［13］发现，ARC是一种信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制剂，可诱导多发性骨髓瘤细胞G2/M期阻滞和凋亡。李孝庆等［14］报道，ARC能降低Bcl-2表达，诱导前列腺癌PC3细胞发生非凋亡性死亡。为阐释ARC对三阴性乳腺癌的治疗作用，本研究探讨ARC对三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人三阴性乳腺癌MDA-MB-453细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号：3111C0001CCC000016）：接种于含有10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2，37℃恒温及饱和湿度细胞培养箱中培养。细胞贴壁生长，稳定传代后，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2 药物、试剂和仪器

ARC（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：N-004-100 mg，纯度＞98%）：溶于细胞培养级DMSO配制浓度为100 mmol·L-1储备液（DMSO终浓度≤0.5%），避光保存于-80℃。实验时取适量储备液，用完全培养基配制浓度为1 mmol·L-1的ARC母液。

RPMI 1640培养基和0.25%胰蛋白酶（批号：SH30809.01和SH30042.01），美国Hyclone公司；胎牛血清（批号：04-001-1ACS），以色列BI公司；CCK-8试剂盒（批号：HY-K0301），美国MCE公司；细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒（批号：KGA512和KGA108），江苏凯基生物技术股份有限公司；GreenNuc™活细胞胱天蛋白酶3活性检测试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：C1168S和P0012），上海碧云天生物技术有限公司；二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（批号：ZB-2306和ZB-2305），北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗：兔抗人周期蛋白依赖性激酶2（cyclindependent kinases，CDK）单抗、兔抗人CDK4单抗、兔抗人细胞周期蛋白D1单抗、小鼠抗人细胞周期蛋白E1单抗、兔抗人P27 KIP1单抗、兔抗人β肌动蛋白单抗（批号：2546T，12790T，2978T，4129T，3686T和4970T），美国CST公司。

倒置相差显微镜和OBSERVER D1/AX10 cam HRC倒置荧光显微镜，德国Zeiss公司；CO2培养箱，德国Binder公司；EON酶标仪，美国BioTek公司；Cytoflex流式细胞仪，美国Beckman公司；Mini P-4小型垂直电泳系统和Mini TBC小型湿式转印电泳槽，北京凯元信瑞仪器有限公司；ChemiDoc MP化学发光成像仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 CCK8法检测细胞存活

取200 μL细胞悬液接种至96孔板（每孔3×104细胞），贴壁生长24 h。用不同浓度ARC（100，200，300，400和500 μmol·L-1）处理24，48和72 h，细胞对照组不予药物干预。加入100 μL CCK8工作液，37℃避光孵育1～2 h，测定450 nm处的吸光度值（A450nm），计算各组细胞存活率。每组设5复孔，实验重复3次。细胞存活率（%）=（药物组A450nm-空白组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白组A450nm）×100%。后续实验均以48 h为药物干预时间。

1.4 平板克隆实验检测细胞克隆形成率

取2 mL细胞悬液接种至6孔板（每孔2000细胞），贴壁生长24 h。加入ARC 25，50，100和200 μmol·L-1处理48 h，细胞对照组不予药物干预。撤药后用新鲜培养基继续培养，当孔板内出现肉眼可见集落时，终止培养，用4%多聚甲醛固定，吉姆萨染色液染色15～30 min，计数克隆，计算各组克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆数/细胞接种量×100%。实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期分布

参照细胞周期检测试剂盒说明书进行。取2 mL细胞悬液接种至6孔板（每孔4×105细胞），贴壁生长24 h。加入适量无血清培养基，饥饿处理8 h。药物干预（同1.3）48 h。收集细胞于2 mL离心管中，350×g离心5 min，用预冷的PBS清洗1～2次，保留细胞沉淀。用300 μL预冷的PBS重悬细胞，缓慢滴加至700 μL预冷的无水乙醇中，混匀后于4℃静置过夜。洗去固定液，加入300 μL PI/RNA酶A染色工作液，室温避光孵育30～60 min。上机检测。利用Modfit LT软件分析细胞周期分布。实验重复3次。

1.6 荧光显微镜观察胱天蛋白酶3活性

参照GreenNuc™活细胞胱天蛋白酶3活性检测试剂盒说明书。取200 μL细胞悬液接种至96孔板（每孔3×104细胞），贴壁生长24 h。药物干预（同1.3）48 h。PBS洗涤1～2次。取适量1 mmol·L-1胱天蛋白酶3荧光耦联底物，用完全培养基稀释至5 μmol·L-1，每孔加入100 μL，室温孵育15～30 min，每组设3复孔，用荧光显微镜定性观察绿色荧光并拍照。绿色荧光越多，表明酶活性越强。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率

参照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。取2 mL细胞悬液接种至6孔板（每孔4×105细胞），贴壁生长24 h。药物干预（同1.3）48 h。收集细胞于2 mL离心管中，350×g离心5 min，用预冷PBS清洗1～2次，保留细胞沉淀。加300 μL结合缓冲液，吹打混匀，再加 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μL PI，室温避光孵育5～15 min。上机检测。利用FlowJo V10软件分析细胞凋亡率。实验重复3次。

1.8 Western印迹法检测CDK2、CDK4、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋E1和P27Kip1蛋白表达

收集ARC（100，300和500 μmol·L-1）组和细胞对照组细胞，分别加适量裂解液，冰上裂解30 min，14 000×g离心15 min，收集上清，采用BCA法测定蛋白质浓度。调整各组蛋白质浓度，加适量5×上样缓冲液，95℃变性5 min。SDS-PAGE垂直凝胶电泳（80V→120 V），200 mA冰浴转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（1∶1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶1000）室温孵育1 h，再次洗膜3次，ECL发光液显影。凝胶成像系统扫描条带，Image J软件进行积分吸光度值（integrated absorbance，IA）分析，计算各组目标蛋白IA与内参蛋白β肌动蛋白IA的比值，表示目标蛋白相对表达水平。实验重复3次。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 ARC对MDA-MB-453细胞存活率的影响

CCK8法结果（图1）显示，与细胞对照组相比，ARC 100，200，300，400 和 500 μmol·L-1可 使MDA-MB-453细胞存活率显著降低（P＜0.01），但同一时间点各浓度组间并无明显差异。然而，在同一浓度下，48 h组细胞存活率明显低于24 h组（P＜0.05，P＜0.01），72 h组细胞存活率明显低于48 h组（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 ARC对MDA-MB-453细胞克隆形成的影响

平板克隆实验结果（表1）显示，与细胞对照组相比，ARC 25 μmol·L-1组MDA-MB-453细胞克隆形成率明显降低（P＜0.05），50，100和200 μmol·L-1组克隆形成率显著降低（P＜0.01），提示ARC能有效抑制该肿瘤细胞的体外增殖。

Fig.1 Effect of arctiin（ARC）on cell viability of MDAMB-453 cells.MDA-MB-453 cells were incubated with ARC 100，200，300，400 and 500 μmol·L-1for 24，48 or 72 h.Cell viability was detected by CCK8 assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol· L-1）group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with corresponding 24 h group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，compared with corresponding 48 h group.

Tab.1 Effect of ARC on clone formation of MDA-MB-453 cells

2.3 ARC对MDA-MB-453细胞周期的影响

流式细胞检测结果（图2）显示，与细胞对照组相比，MDA-MB-453细胞经ARC 100，200，300，400和500 μmol·L-1处理48 h后，G0/G1期细胞百分比显著增加（P＜0.01），S期细胞百分比显著降低（P＜0.01），G2/M期细胞百分比无明显变化，提示ARC可干预细胞周期进程。

Fig.2 Effect of ARC on cell cycle of MDA-MB-453 cells by flow cytometry.MDA-MB-453 cells were incubated with ARC 100，200，300，400 and 500 μmol·L-1for 48 h.B was quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

2.4 ARC对MDA-MB-453细胞内胱天蛋白酶3活性的影响

胱天蛋白酶3荧光染色结果见图3，细胞对照组处于正常生长状态，胞内胱天蛋白酶3活性低，镜下几乎未见绿色荧光；ARC各浓度组镜下也仅可见零星绿色荧光，提示MDA-MB-453细胞经ARC刺激后胞内胱天蛋白酶3活性未明显提高。

2.5 ARC对MDA-MB-453细胞凋亡的影响

细胞对照组和 ARC 100，200，300，400 和500 μmol·L-1组细胞死亡率分别为（5.9±1.6）%，（15.1±1.3）%，（15.1±0.5）%，（12.1±1.1）%，（13.8±2.6）%和（15.0±2.1）%（均P＜0.05）（图4）。与细胞对照组相比，ARC各浓度组凋亡晚期与坏死细胞百分比显著升高（P＜0.01），但早凋细胞百分比无显著差异，提示ARC可能未诱导该细胞凋亡。

2.6 ARC对MDA-MB-453细胞CDK2、CDK4、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1和P27蛋白表达的影响

Western印迹结果（图5）显示，与细胞对照组相比，ARC 100，300和 500 μmol·L-1组 MDA-MB-453细胞内CDK4和细胞周期蛋白D1蛋白水平明显下降（P＜0.01），CDK2和细胞周期蛋白E1无明显变化；ARC 100和300 μmol·L-1组P27蛋白水平显著增加（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of ARC on activity of caspase 3 in MDA-MB-453 cells.See Fig.2 for the cell treatment.The cells were fluorescent-stained and observed under a fluorescence microscope（GFP channel，×200）.The more intense green fluorescence，the stronger the caspase 3 activity.

Fig.4 Effect of ARC on apoptosis of MDA-MB-453 cells by flow cytometry.See Fig.2 for the cell treatment.B was quantitative result of A.±s,n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

Fig.5 Effect of ARC on protein expressions of cyclin dependent kinases（CDK）2，CDK4，cyclin D1，cyclin E1 and P27 in MDA-MB-453 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.IA：integrated absorbance.B was semi-quantitative result of A.±s.n=3，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（ARC 0 μmol·L-1）group.

3 讨论

本研究实验结果表明，ARC不仅能有效降低MDA-MB-453细胞的存活率，还可显著减少单个细胞的克隆形成率，提示ARC对三阴性乳腺癌MDAMB-453细胞体外增殖能力具有抑制作用，ARC或能应用于三阴性乳腺癌的治疗。

恶性肿瘤的发生发展通常与细胞周期异常具有密不可分的关系。目前，细胞周期抑制剂已成为三阴性乳腺癌治疗策略的研究方向之一，如CDK4/6抑制剂（帕博西尼）对Rb基因高表达的三阴性乳腺癌细胞具有明显抑制作用［15-18］。本研究结果显示，ARC干预MDA-MB-453细胞后，S期细胞百分比明显下降而G0/G1期细胞百分比明显升高，推测ARC可能干扰细胞周期进程，可导致MDA-MB-453细胞发生G0/G1期阻滞。细胞周期受到精确且复杂的程序调节，其中CDK/细胞周期蛋白异源二聚体和CDK抑制因子是推动细胞周期运行的重要因素。细胞周期蛋白D是肿瘤细胞恶性增殖的重要因素之一，在多数乳腺癌细胞中均高表达［19］。一般而言，细胞周期蛋白D主要在G1期表达，能与CDK4/6结合形成复合物，磷酸化Rb蛋白，促进E2F转录因子释放和一系列相关基因转录，协同CDK2/细胞周期蛋白E推动G1/S期转化［20-21］。P27属非特异性CDK抑制因子，是G1/S检查点的关健分子，能与细胞周期蛋白D竞争性结合CDK4，导致G1期无法向S期转换［22-23］。CDK4和细胞周期蛋白D表达降低或P27表达升高均会导致G0/G1期阻滞，从而促使肿瘤细胞增殖抑制。既往研究显示，ARC可通过下调细胞周期蛋白D1表达以抑制骨肉瘤、肺癌、结直肠癌和乳腺癌等肿瘤细胞增殖［12］。本研究发现，经不同浓度ARC干预后MDA-MB-453细胞内P27蛋白水平显著上调，CDK4和细胞周期蛋白D1蛋白水平明显下调，CDK2和细胞周期蛋白E1表达未受影响，与先前报道一致［12］。由此可见，ARC可能通过调控CDK4、细胞周期蛋白D1和P27的表达来干扰MDA-MB-453细胞周期的进程。

细胞凋亡失衡是导致肿瘤无限增殖的另一重要因素，故调控肿瘤细胞凋亡过程也是肿瘤治疗的热点策略。胱天蛋白酶家族是存在于细胞质中一组具有高度同源性的蛋白酶，在细胞凋亡中扮演着重要角色，其中胱天蛋白酶3是细胞凋亡途径上的终末剪切酶，可作为标志性蛋白反映细胞凋亡状态。研究表明，ARC可通过胱天蛋白酶依赖性线粒体途径诱导多发性骨髓瘤［13］、肝癌［24］和胰腺癌［25］等肿瘤细胞发生凋亡。然而，本研究结果显示，MDAMB-453细胞在经过ARC处理48 h后，胞内胱天蛋白酶3酶活化水平和早期凋亡水平均无显著提高，提示凋亡诱导可能并非ARC发挥抗肿瘤效应的作用方式。由于ARC组细胞坏死率较细胞对照组有小幅度提升（3.4%→10.0%），推测ARC或许可造成MDA-MB-453细胞非凋亡性坏死，与李孝庆等［14］报道相似，这可能不是造成MDA-MB-453细胞生长抑制的主要原因。

综上，ARC能有效抑制三阴性乳腺癌MDAMB-453细胞增殖且可干预细胞周期进程，其作用机制可能与下调CDK4、细胞周期蛋白D1蛋白水平和上调P27表达有关。本研究扩展了ARC在抗肿瘤方面的潜在应用，在持续深入开展机制研究的基础上，ARC有望开发为一种靶向细胞周期治疗的抗肿瘤药物。但本研究仅在细胞水平进行了探讨，结果具有局限性，是否存在其他作用机制有待进一步研究。