竹醋液与漂白液对大肠杆菌抑菌杀菌效果对比

袁花艳,周献峰,徐伟兵（广东省惠州市惠阳区疾病预防控制中心,广东 惠州 516211）

近年来含氯消毒剂的发展较快，由以前的氯气及主要含次氯酸钙的漂白粉，发展到现在的二氧化氯、氯化溴和氯代异氰尿酸等高效、快速、广谱的消毒剂[1]，但漂白液依然是日常生活中常使用的消毒剂。然而含氯消毒剂也有其自身的弱点，它的杀菌性能易受到有机物及酸碱度的影响，对物品有一定的腐蚀作用，有些含氯消毒剂不够稳定，容易分解，消毒剂还能与体系中的芳香族化合物反应生成剧毒的物质，污染环境，危害人体健康。竹醋液是20世纪末日本率先开发成功的一种纯天然绿色环保产品，主要成分为水（约含80%），次要成分为有机酸类（约含7%-11%，其中醋酸约含6%）、酚类（约含6%-8%）、酮类（约含0.8%-1%）、醛类（约含0.02%-1%）、醇类（约含0.01%-1%）和一些微量成分（约含0.05%-1%），成分随着热解温度、炭化设备、精制方法、储存条件等的不同而变化[2]。在日本、韩国等国竹醋液在农林业上的研究应用已较为广泛。据研究，竹醋液具有杀菌、杀虫、保鲜除臭、无毒副作用等诸多优异的特性[3-5]；竹醋液在农业上可以用于调节植物的生长，促进植物的发芽[6]；在医药卫生和环境保护上可以作杀菌剂和抑菌剂使用[7]。但将竹醋液与其他种类的消毒剂比较研究国内外都较少，因此本研究就是通过将竹醋液作为消毒剂对大肠杆菌抑制杀灭方面的应用，以及与漂白液进行比较，根据结果为竹醋液在某些应用部分或者全部替代漂白液提供参考，以减少化学消毒剂的用量，为以后环保消毒剂的开发提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

1.1.1 实验材料 竹醋液：由广东自然堂生物有限公司提供，pH=2-3。漂白液：商品名：蓝月亮漂白液，生产厂家：广州蓝月亮实业有限公司，净含量为1.2kg，有效氯含量为40000mg/L，pH=12-13，生产期为2019年2月3日，有效期至2021年2月3日。标准硬水（硬度342mg/L）；胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）；营养琼脂培养基；营养肉汤培养基；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），实验试剂制备以及应用参考《2008年消毒技术规范》进行[8]。大肠杆菌由惠阳疾控微生物室提供。用打孔机制备直径为7mm的纸片，高压后备用。

1.1.2 实验仪器 ①不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。②电热恒温培养箱（湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司）。③电热恒温鼓风干燥箱（湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司）。④三角恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液配制方法 吸取5.0mL稀释液加入到第6代大肠杆菌菌种的新鲜斜面琼脂培养基，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上拍打80次，以使细菌悬浮均匀。制备成实验标准的菌悬液浓度。

1.2.2 消毒剂配制方法 分别取五体积的竹醋原液与五体积无菌水将其混合均匀，并对该稀释液进行逐级稀释（即二倍稀释），稀释成竹醋液浓度分别为50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%和1.5625%以及原液七个浓度梯度；分别取五体积漂白液与五体积无菌水将其混合均匀，并对该稀释液进行逐级稀释（即二倍稀释），稀释成漂白液浓度分别为20000mg/L、10000mg/L、5000mg/L、2500mg/L、1250mg/L和625mg/L以及原液七个浓度梯度；将竹醋液替代标准硬水，按照上述方法操作以及稀释梯度，稀释漂白液得到相应的六个稀释浓度。

1.2.3 活菌培养计数技术 活菌培养计数使用平板倾注法，操作程序如下：取10支试管置于试管架上，每管加入4.5mL稀释液。由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3、……、10-10 。用1.0ml试管吸取0.5mL新鲜的第六代大肠杆菌菌悬液加入10-1管内。将10-1管依前法在手掌上用力振打80次，混匀，再吸取出0.5mL加入10-2管内，如此类推，直至10-10管。

取6个平皿，由左至右，逐皿标上10-5至10-10，取出10-5至10-10菌悬液管，吸取其中混合均匀的悬液1.0mL对号加于各个无菌平皿内。每个稀释度接种两个平皿。将40℃-45℃熔化的培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15mL-20mL。将平皿盖好，即刻轻轻摇动均匀，平放。待琼脂凝固后，反转平皿使底向上置37℃恒温培养箱内培养48小时。

培养至48小时后，观察并计算各平皿的菌落数。记录每平板菌落数在15cfu-300cfu的稀释度。一般含菌量约为1×108cfu/mL-5×108cfu/mL。平行三次试验，组间误差率不应该超过10%，计数平均结果符合标准。平板间误差率=（板间菌落平均数/板间菌落平均数）×100%。

1.2.4 中和剂的鉴定 在细菌杀灭试验中所用中和剂的鉴定，至少应平行进行以下各组试验。

第1组：中和剂+菌悬液→培养

第2组：（消毒剂+中和剂）+菌液→培养

第3组：稀释液+菌悬液→培养

第4组：稀释液+中和剂+培养基→培养

实验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格。

①第1、2和3组有相似量试验菌生长，悬液试验作用体系中菌量在50cfu/mL-300cfu/mL之间。其组间菌落数误差率应不超过15%。第1、2和3组间菌落数误差率计算公式如下：

②第4组无菌生长。

③试验重复3次，每次试验均应符合以上要求。

1.2.5 抑菌环测定 采用平板扩散法分别用移液加样器取五个浓度梯度药剂8ul加于7mm的圆形小滤纸片上，然后用灭菌镊子将带药滤纸片（称纸碟）放入皿内接过0.2ml含菌量为7.43×108cfu/mL的培养基上，每皿放三片（竹醋液、漂白液、对照），重复三次，各纸碟间距离要适宜，放置时要平放，迅速、准确，放下后就不能再移动，每放一片要立即盖上皿盖防污染，经过37℃培养箱中培养24h培养后，测定抑菌圈直径，正确测量各菌抑菌圈直径，精确到0.5mm。试验重复3次。

1.2.6 最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度。取竹醋液5mL，加入装有5mL液体培养基的试管中，摇匀后取5mL置于另一支装有5mL液体培养基的试管中，稀释为含有不同浓度竹醋液5mL混合液，依次类推，最后一管弃去5mL的混合液，并设对照组（一管为生长对照管，一管为空白对照管，均不含竹醋液或者漂白液），取菌悬液含菌量为7.43×108cfu/mL0.1mL接种于各试管中和生长对照管中，充分摇匀，细菌在37℃下培养24h。观察试管澄清度，若液体培养基混浊，表示细菌生长，若液体培养基完全清亮，表示无细菌生长。无细菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度。试验重复3次。

1.2.7 最小杀菌浓度（MBC）的测定 最小抑菌浓度（MIC）测定实验中，从最小抑菌浓度检测结果的澄清液体培养基中取出0.1mL，涂布平板，细菌置37℃温箱中培养24h，观察有无菌落生长。无菌落生长的最小浓度为最小杀菌浓度。试验重复3次。

1.2.8 杀菌率的测定 根据MBC的结果，每种消毒液作3个浓度梯度的配比液。取4.5mL竹醋液，加入装有4.5mL标准硬水的试管中。摇匀后再吸取4.5ml混合液，加入另一支装有4.5mL标准硬水的试管中，如此类推，直至最后一管。最后一管摇匀后再吸4.5mL混合液，弃去，作竹醋液稀释液（竹醋液加标准硬水）。挑选MBC浓度及临近的3支竹醋液与硬水的配比液，加入0.5mL含菌量为7.43×105cfu/mL菌悬液，混合摇匀并开始计时。分别于2分钟、5分钟、10分钟、20分钟时各吸取0.5mL混合液移入相应的

装有4.5mL中和剂的试管中混匀。中和10分钟后吸取0.2mL移入平皿，加入TSA，摇匀，待TSA凝固后放入37℃恒温培养箱中培养24小时，观察细菌生长情况。用TPS稀释液做对照组。试验重复3次。

2 结果

2.1 菌落计数结果 符合稀释后菌数计数在15-300的都只是稀释到108时才符合，通过计算可以得到三组数据的误差率为9.86%，菌落计数结果为7.43×109，见表1。

表1 大肠杆菌菌落计数（cfu/ml）

2.2 中和剂鉴定结果 漂白液第1、2、3和4组菌落计数为171、165、162和0；竹醋液第1、2、3和4组菌落计数为171、170、162和0。

根据上述的计算公式，可知分别用漂白液、竹醋液作为消毒剂时，计算出本次中和剂实验鉴定的组间菌落数误差率分别为2.00%和2.38%。结果均符合中和剂鉴定的要求，因此判定该中和剂合格。

2.3 抑菌环实验结果 相同稀释倍数的情况下漂白液的抑菌圈大于竹醋液的抑菌圈，而漂白液和竹醋液的混合液抑菌圈明显大于前面两个消毒剂。此外，当稀释倍数达到1∶8时，随着稀释倍数的增加，竹醋液的抑菌圈大小改变不明显。见表2。

表2 消毒剂的抑菌圈（单位为cm）

2.4 MIC测定结果 竹醋液与漂白液最低抑菌稀释度都是1∶64，即竹醋液含量为1.5625%，漂白液的浓度为625mg/L，MIC由大到小分别为漂白液、竹醋液以及漂白液与竹醋液混合液。见表3。

表3 最小抑菌浓度结果

2.5 MBC测定结果 竹醋液的MBC为二倍稀释到1∶16即竹醋液含量为6.25%，而漂白液是到1∶64即浓度为625mg/L，漂白液的最小杀菌浓度比竹醋液要小，而漂白液与竹醋液混合液的最小杀菌浓度比前两者都要小。见表4。

表4 最小杀菌浓度结果

2.6 杀菌率测定结果 同等稀释倍数的情况下，漂白液的杀菌能力要比竹醋液强，而漂白液与竹醋液混合液的杀菌能力比前两者均要强。见表5、表6。

表5 杀菌计数结果（cfu/ml）

表6 杀菌率计算结果[n(%)]

3 讨论

竹醋液可以广泛应用于农业生产、医疗保健、食品加工、处理污水等多个领域，但在抗菌消毒方面尚有待于开发[9]。与之相比较的漂白液早已在多个领域的消毒中广泛应用，但含氯消毒剂理化性质不稳定，易受pH、有机质和还原物质的影响，受日光的照射易分解失效，难以贮存，而且对人体健康也会造成危害。

本次实验结果显示在相同稀释倍数的情况下漂白液的抑菌圈均大于竹醋液的抑菌圈，当竹醋液替代标准硬水为稀释液时，此时抑菌圈明显大于前面两个消毒剂的抑菌圈。另外随着稀释倍数的增加，竹醋液抑菌圈大小的改变并不是特别明显。在MIC的测定结果上竹醋液与漂白液之间的比较上并无明显区别，最低杀菌稀释率均为1∶64，即竹醋液含量为1.5625%，漂白液的浓度为625mg/L。而从MBC的实验结果数据和杀菌率的结果可以看出，漂白液均要优于竹醋液，竹醋液和漂白液复配液的MBC和杀菌率又均高于漂白液和竹醋液。此次研究结果与国内的周建斌等[10]、李忠琴[11]、蒋新龙[12]研究结果一致，表明竹醋液有一定的抑菌杀菌作用。该实验中竹醋液与漂白液的混合比例，由于时间问题并没有广泛开展研究，而这些问题都有待进一步的实验探讨，使得竹醋液更好地被利用。

漂白液和竹醋液都具有一定的抑菌杀菌作用[13-15]。竹醋液可以在抑菌方面替代或者部分替代漂白液使用，而且竹醋液与漂白液混合有比较明显的增效作用，可以达到更好抑菌效果，加上竹醋液是一种天然绿色产品，对环境无污染，这为以后减少漂白剂的使用以及其他有害环境的消毒剂使用提供了参考，为新型环保消毒剂的开发利用提供了参考。