lncRNA CCDC183-AS1通过靶向miR-1301-3p调控胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭

张红英,何陈聪,钟定福

张红英,何陈聪,钟定福,金华市人民医院消化内科 浙江省金华市321000

0 引言

胃癌是全球最常见恶性肿瘤之一.饮食、感染、吸烟、肥胖和幽门螺杆菌等都与胃癌的发生发展有关[1].据报道,2018年全球新增胃癌数量超1000万,死亡人数783万[2].目前治疗方法主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫基因治疗等,但由于晚期、耐药和高复发率,患者5年生存率低于30%[3].因此,亟待寻找有效的治疗手段.长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸且不具有编码蛋白功能的转录本,众多研究表明,lncRNAs参与人类多种癌症的发生、发展及预后[4].lncRNA CCDC183-AS1位于人类Chr 9q34.3区域,研究发现,在肝细胞癌中,lncRNA CCDC183-AS1高表达与患者低总生存率有关,并促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤的生长和转移[5].然而lncRNA CCDC183-AS1在胃癌中的表达和作用尚不明确,StarBase预测显示,lncRNA CCDC183-AS1与miR-1301-3p具有互补核苷酸序列.研究报道[6],沉默miR-1301-3p可消除下调LINC01207对胃癌细胞生长和迁移的抑制作用.尽管已有研究确定miR-1301-3p在胃癌中的作用,但lncRNA CCDC183-AS1在胃癌中的作用以及其分子机制是否与miR-1301-3p有关还尚未可知.因此,本实验以胃癌AGS细胞为体外研究对象,探讨lncRNA CCDC183-AS1是否通过靶向调控miR-1301-3p表达来影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭.

1 材料和方法

1.1 材料 选取本院2017-01/2019-01期间经病理检测为胃癌的患者30例,获得原发性胃癌组织及相应癌旁组织,每位患者均知情且同意,手术切除后立即将样本保存在-80 ℃.本研究经本院伦理委员会批准.胃癌AGS细胞系购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清、DMEM培养基购自美国Hyclone公司;Trziol、反转录、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RTqPCR)试剂盒购自日本Takara公司;四甲基偶氮唑盐比色法(methye thiazolye telrazlium,MTT)试剂购自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室购于美国密理博公司;RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞转染与分组:取对数生长期AGS细胞,将si-NC、si-CCDC183-AS1、miR-NC、miR-1301-3p分别转染至其中,记为si-NC组、si-CCDC183-AS1组、miRNC组、miR-1301-3p组;将si-CCDC183-AS1分别与antimiR-NC、anti-miR-1301-3p共转染至AGS细胞中,记为si-CCDC183-AS1+anti-miR-NC组、si-CCDC183-AS1+antimiR-1301-3p组.

1.2.2 RT-qPCR:提取细胞总RNA,反转录成cDNA,lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p分别以GAPDH和U6为内参,相对表达量采用2-△△Ct法计算.lncRNA CCDC183-AS1上游引物序列:5'-GACTTGATCCGTTGGCCTGA-3',下游引物序列:5'-CTTGGACTTCCCCTCGAACC-3';miR-1301-3p上游引物序列:5'-TTACAGCTGCCTGAGAGTGACTTA-3',下游引物序列:5'-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCA-3';GAPDH上游引物序列:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游引物序列:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3';U6上游引物序列:5'-CGCTTCGGCAGGCATTATATAC-3',下游引物序列:5'-AAGGGGCCATGCTAATCTT-3';引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2.3 MTT检测细胞活性:取各组AGS细胞(2.5×104个/mL),接种于96孔板(100 μL/L),培养48 h后,加入MTT溶液20 μL/孔,培养4 h,弃上清,加入DMSO 150 μL/孔,室温震荡孵育5 min,酶标仪检测450 nm处的OD值.

1.2.4 Transwell检测细胞迁移与侵袭:Transwell小室上室接种AGS细胞(5×104个/孔),下室加入600 μL(含10%胎牛血清)培养液,37 ℃下孵育24 h后,棉签擦去未穿膜细胞.多聚甲醛固定,0.1%结晶紫染色.置于显微镜下计数.

1.2.5 Western blot检测蛋白表达:提取各组细胞总蛋白,BCA试剂盒进行定量.各组蛋白上样量60 μg,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后,转至聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育2 h,暗室中曝光显影,定影,Image J软件分析目的蛋白的相对表达量.

1.2.6 双荧光素酶报告实验:StarBase预测显示lncRNA CCDC183-AS1与miR-1301-3p存在结合位点,构建CCDC183-AS1野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-CCDC183-AS1和MUT-CCDC183-AS1,将其分别与miR-NC和miR-1301-3p共转染至AGS细胞中,按照说明书检测荧光素酶活性.

统计学处理采用SPSS 21.0统计学软件分析数据,每组实验重复9次,计量资料以(mean±SD)表示且均符合正态分布,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在胃癌组织中的表达 与癌旁组织比较,胃癌组织中CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表达水平分别显著升高和降低(P<0.05);与人正常胃粘膜细胞GES-1比较,胃癌细胞AGS、N87、HGC-27、SNU-484中CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表达水平分别显著升高和降低(P<0.05)(表1,表2).后续实验选用AGS细胞.

表1 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在胃癌组织中的表达(mean±SD,n=30)

表2 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在不同胃癌细胞中的表达(mean±SD,n=9)

2.2 抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染si-CCDC183-AS1后,AGS细胞中CCDC183-AS1的表达水平降低,OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)表达水平降低,p21表达水平升高(P<0.05)(图1,表3,表4).

图1 抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A:迁移侵袭图;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表达.MMP-2:基质金属蛋白酶2;MMP-9:基质金属蛋白酶9;lncRNA:长链非编码RNA.

表3 抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响(mean±SD,n=9)

表4 抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表达的影响(mean±SD,n=9)

2.3 lncRNA CCDC183-AS1靶向调控miR-1301-3p的表达(StarBase Predicted) StarBase预测的lncRNA CCDC183-AS1与miR-1301-3p的互补核苷酸序列(图2).转染miR-1301-3p的WT-CCDC183-AS1荧光素酶活性降低(P<0.05)(表5).lncRNA CCDC183-AS1靶向调控miR-1301-3p表达(P<0.05)(表6).

图2 CCDC183-AS1的序列中含有与miR-1301-3p互补的核苷酸序列.

表5 双荧光素酶报告实验(mean±SD,n=9)

表6 lncRNA CCDC183-AS1调控miR-1301-3p表达(mean±SD,n=9)

2.4 过表达miR-1301-3p对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 转染miR-1301-3p后,AGS细胞中miR-1301-3p的表达水平升高,OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平降低,p21表达水平升高(P<0.05)(图3,表7,表8).

图3 过表达miR-1301-3p对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A:迁移侵袭图;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表达.MMP-2:基质金属蛋白酶2;MMP-9:基质金属蛋白酶9.

表7 过表达miR-1301-3p对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响(mean±SD,n=9)

表8 过表达miR-1301-3p对胃癌AGS细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表达的影响(mean±SD,n=9)

2.5 下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响 共转染si-CCDC183-AS1、anti-miR-1301-3p后,AGS细胞中miR-1301-3p的表达水平降低,OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平升高,p21表达水平降低(P<0.05)(图4,表9,表10).

图4 下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A:迁移侵袭图;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表达.MMP-2:基质金属蛋白酶2;MMP-9:基质金属蛋白酶9;lncRNA:长链非编码RNA.

表9 下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响(mean±SD,n=9)

表10 下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表达的影响(mean±SD,n=9)

3 讨论

越来越多证据表明,lncRNAs在胃癌发生发展中的作用,如lncRNA KCNQ1OT1在胃癌组织和细胞中高表达,敲减lncRNA KCNQ1OT1可抑制肿瘤生长、细胞活力和集落形成,促进细胞凋亡,lncRNA KCNQ1OT1通过miR-145-5p/ARF6轴促进胃癌进展[7].在胃癌中,LINC01224和CDK8表达上调,miR-193a-5p表达下调,LINC01224促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,下调miR-193a-5p部分消除了沉默LINC01224对胃癌细胞恶性行为的抑制作用[8].lncRNA HOXA-AS3的高表达与胃癌肿瘤大小、淋巴结状态、浸润深度和幽门螺杆菌感染状态相关,敲除lncRNA HOXA-AS3可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤转移[9].与正常胃粘膜上皮细胞相比,胃癌细胞中lncRNA SNHG4表达水平升高,下调其表达通过靶向上调miR-204-5p抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,并阻断细胞周期的进程[10].lncRNA HIF1A-AS2在胃癌组织和细胞中表达升高,下调miR-429消除了敲减lncRNA HIF1AAS2对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用[11].lncRNA HCP5通过miR-519d/HMGA1轴增强胃癌细胞的增殖和顺铂耐药性[12].与上述结果一致,本实验结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中lncRNA CCDC183-AS1表达水平显著升高,抑制lncRNA CCDC183-AS1表达显著降低了胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力.CyclinD1促进细胞周期由G1期到S期的转变,其过表达可促进细胞增殖,导致细胞增殖异常[13],而p21发挥肿瘤抑制作用,促进多种刺激下的细胞周期阻滞[14,15].MMPs在癌细胞的侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用,MMP-2、MMP-9是MMPs家族的两个重要成员,是癌细胞转移的关键调控因子[16,17].本实验结果显示,抑制lncRNA CCDC183-AS1表达后,CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达水平降低,p21表达水平升高,进一步说明lncRNA CCDC183-AS1对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用.

研究表明lncRNAs可作为ceRNA或“分子海绵”负调控肿瘤相关miRNA表达来促进胃癌进展[7-12].本实验的StarBase预测显示,lncRNA CCDC183-AS1与miR-1301-3p含有互补核苷酸序列,双荧光素酶报告实验显示,在WT-CCDC183-AS1中,转染miR-1301-3p的荧光素酶活性显著降低,lncRNA CCDC183-AS1靶向负调控miR-1301-3p表达.研究表明,miR-1301-3p参与了多种癌症细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,下调miR-1301-3p可逆转敲减circ_0004370对食管癌细胞恶性行为的抑制作用[18].miR-1301-3p的低表达与甲状腺乳头状癌的T、N分级升高显著相关,上调miR-1301-3p通过下调PCNA表达抑制TPC-1细胞的增殖[19].在膀胱癌细胞中,lncRNA NNT-AS1和PODXL表达升高,miR-1301-3p表达降低,lncRNA NNTAS1通过靶向miR-1301-3p/PODXL轴和激活Wnt通路促进细胞生长[20].miR-1301在骨肉瘤细胞中低表达,表阿霉素通过调控miR-1301/TRIAP1轴抑制骨肉瘤细胞的增殖,并促进细胞凋亡[21].miR-1301-3p的低表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期密切相关,上调miR-1301-3p通过靶向下调ICT1表达抑制乳腺癌细胞的增殖,促进细胞凋亡[22].与前人研究结果一致,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-1301-3p表达显著降低,过表达miR-1301-3p显著降低了胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力.且下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响.提示lncRNA CCDC183-AS1可能通过调控miR-1301-3p表达影响AGS细胞的增殖、迁移和侵袭.

4 结论

综上所述,lncRNA CCDC183-AS1在胃癌组织中表达上调,抑制lncRNA CCDC183-AS1通过靶向上调miR-1301-3p表达降低胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力.这意味着lncRNA CCDC183-AS1可能是治疗胃癌的新靶点,但仅限于体外实验,其在体内的作用及调控机制还有待进一步研究.

文章亮点

实验背景

胃癌的致病机理尚不明确,已有研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的异常表达与胃癌细胞的恶性生物学行为有关,但lncRNA CCDC183-AS1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响尚未可知.

实验动机

lncRNA CCDC183-AS1在肝细胞癌中表达上调,促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤的生长和转移,但其对胃癌细胞的影响及分子机制还尚未可知.StarBase预测显示,lncRNA CCDC183-AS1可能靶向结合miR-1301-3p.已有研究称,沉默miR-1301-3p可消除下LINC01207对胃癌细胞生长和迁移的抑制作用.但lncRNA CCDC183-AS1能否靶向调控miR-1301-3p影响胃癌细胞 的增殖、迁移和侵袭尚不清楚.因此,探究lncRNA CCDC183-AS1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其能否靶向miR-1301-3p发挥作用,以期为胃癌治疗提供新思路.

实验目标

探究lncRNA CCDC183-AS1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其能否靶向miR-1301-3p发挥作用,为胃癌治疗提供新思路.

实验方法

RT-qPCR检测胃癌组织和细胞中lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表达.分别转染lncRNA CCDC183-AS1小干扰RNA、miR-1301-3p模拟物至胃癌细胞AGS中,RT-qPCR检测其转染效果,MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测CyclinD1、p21、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)蛋白表达.双荧光素酶报告实验验证lncRNA CCDC183-AS1与miR-1301-3p的靶向调控关系.

实验结果

胃癌组织中lncRNA CCDC183-AS1高表达,miR-1301-3p低表达.抑制lncRNA CCDC183-AS1表达或高表达miR-1301-3p可降低AGS细胞OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平,提高p21表达水平.lncRNA CCDC183-AS1可靶向负调控miR-1301-3p表达,下调miR-1301-3p表达逆转了抑制lncRNA CCDC183-AS1表达对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用.

实验结论

胃癌组织中lncRNA CCDC183-AS1表达升高,抑制lncRNA CCDC183-AS1表达可降低AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其分子机制可能与靶向上调miR-1301-3p有关,为胃癌的靶向分子治疗提供了新靶点.

展望前景

miR-1301-3p下游靶基因以及信号通路在胃癌进展中的作用还未知,且本研究仅仅限于体外实验,还需进一步验证lncRNA CCDC183-AS1/miR-1301-3p轴在裸鼠移植瘤实验中对胃癌进展的作用.