亚硝酸盐快速检测试剂研究及其在酱腌菜中的应用

杨建飞，马 倩，左 勇,*，黄雪芹，徐 佳，王定丽，周耀进，杨柯怡

（1.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101；2.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000）

酱腌菜是我国的传统美食，具有方便即食、风味独特、制作简易等优点，深受广大消费者喜爱，然而酱腌菜中亚硝酸盐含量超标的现象屡见不鲜[1]，食用酱腌菜是人体摄入亚硝酸盐的来源之一，若人体摄入较高的亚硝酸盐，具有患高铁血红蛋白症、1型糖尿病和癌症的风险[2-3]，因此，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和食品科学委员会（Scientific Committee on Food，SCF）规定亚硝酸盐的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）值为0～0.06 mg/kg（以体质量计）[4-5]。由此可见，在食品卫生检验、食品安全等方面，亚硝酸盐的含量测定具有重要意义。

现有的亚硝酸盐检测方法主要分为光谱法、色谱法、电化学分析法和快速检测法共4 类[6]，其中光谱法主要指GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》的分光光度法[7]（以下简称GB法），是目前国际通用的亚硝酸盐定量检测法[8]，但此方法以强挥发性和强腐蚀性的浓盐酸作酸性介质，测定流程由于分2 步进行而具有危险和耗时的缺点。色谱法可准确定量，但需要精密仪器和专业的技术人员，检测费用昂贵，适合实验室或科研使用[9]。电化学分析法能够快速、准确测得亚硝酸盐的响应值[10]，但电极材料的选择及制备过程繁琐，使用寿命有限[11-12]。快速检测法是基于比色原理对样品亚硝酸盐进行定性或半定量的方法[13-14]，具有操作简单、成本低、耗时短（3～5 min）等优点[15]，已在土壤[16]、临床[17]、水样[18-19]、食品[20]等领域受到广泛关注和应用，但比色法制备的许多液体、固体、试纸型的试剂盒有较高检出限、假阳性、保质期短等缺点[21]。因此，研究适用于酱腌菜中亚硝酸盐快速定量的检测试剂具有重要意义。

本实验以GB法作对照，使用重氮试剂和偶合试剂的混合溶液代替GB法的2 步反应，本实验还研究可代替浓盐酸的安全酸性介质，同时探究3 组重氮-偶合试剂（重氮试剂：对氨基苯磺酸、对氨基苯乙酮、磺胺；偶合试剂：盐酸萘乙二胺，分别为对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺组、对氨基苯乙酮-盐酸萘乙二胺组、磺胺-盐酸萘乙二胺组，以下简称DS组、DT组、HA组）在酱腌菜中的适用性，以期为酱腌菜中亚硝酸盐的快速定量检测提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱腌菜 四川宜宾市售；亚硝酸钠、苹果酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、磷酸、对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮、盐酸萘乙二胺（均为分析纯） 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；ME104E/02电子天平 托利多仪器（上海）有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅 上海乔欣科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亚硝酸盐的检测原理和方法

样品前处理和亚硝酸盐的测定原理依据GB法[7]。取1 mL质量浓度4 g/L的重氮试剂（对氨基苯磺酸或对氨基苯乙酮或磺胺）、质量浓度2 g/L的偶合试剂（盐酸萘乙二胺）0.5 mL于试管中，用蒸馏水补至4.5 mL后摇匀，加入质量浓度1 μg/mL亚硝酸钠标准溶液0.5 mL，摇匀后反应15 min，500～560 nm波长处扫描，确定每组重氮-偶合试剂的最大测定波长，取1 mL样品提取液测定亚硝酸盐含量。

1.3.2 亚硝酸盐快速检测条件的优化

研究酸性介质的种类（苹果酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、丁二酸）、酸性质浓度（0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L）、重氮试剂质量浓度（2、4、6、8、10、12 g/L）、偶合试剂质量浓度（0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 g/L）、重氮-偶合试剂体积比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、1∶2）、反应时间3、6、9、12、15、18、21 min）对亚硝酸盐吸光度的影响，并采用4因素3水平的正交试验分别优化DS组、HA组、DT组测定亚硝酸盐的条件。正交试验因素水平设计见表1～3。

表1 DS组正交试验因素与水平Table 1 Independent variables and levels used for orthogonal array design for optimization of ASA-NED method

表2 HA组正交试验因素与水平Table 2 Independent variables and levels used for orthogonal array design for optimization of AAP-NED method

表3 DT组正交试验因素与水平Table 3 Independent variables and levels used for orthogonal array design for optimization of SN-NED method

1.3.3 亚硝酸盐快速检测试剂的检测性能

以GB法作对照，研究DS组、HA组、DT组应用于酱腌菜样品时的抗干扰能力、准确度、精密度、检出限和线性范围。

1.3.3.1 检出限和线性范围

按各组试剂的最优组合测定系列质量浓度梯度的亚硝酸盐标准溶液，研究DS组、HA组、DT组的检出限和线性范围，并采用3δ法[22]计算检出限。

1.3.3.2 抗干扰能力

为探究本实验中亚硝酸盐检测试剂在酱腌菜中的实际应用性，选择酱腌菜中含有的食品添加剂和自身水溶性成分，如山梨酸钾、苯甲酸钠、D-异抗坏血酸钠、安赛蜜、有机酸、氨基酸等，按亚硝酸盐浓度的10～2 000 倍进行干扰实验。

1.3.3.3 准确度

准确度通常以回收率表示。回收率是指反应待测物在样品分析过程中的损失程度，损失越少，回收率越高，也说明该检测方法准确性越高[23]。首先，按3 组检测试剂最优方法分别测定样品亚硝酸盐的本底值，然后于待测液中加入已知质量浓度的亚硝酸盐标准溶液以调整亚硝酸盐标准溶液质量浓度为1 μg/mL，最后再次测定亚硝酸盐含量，计算回收率[24]。

1.3.3.4 精密度

精密度表示实验方法的重复性，以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示[25]，通过重复测定5 次样品中亚硝酸盐含量计算精密度。

1.3.4 亚硝酸盐快速检测试剂的贮存稳定性

为研究亚硝酸盐快速检测试剂的实际应用性，对其在25、4、30、40 ℃的避光条件的贮存稳定性进行测定。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行正交试验设计和差异显著性分析；采用Origin 2018进行图表的绘制。每组实验设3 个平行。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐检测波长的测定

由图1可知，在520～560 nm范围内，DS组和HA组的最大吸收波长均为540 nm，DT组的最大吸收波长为550 nm，因此选择DS组、DT组、HA组的亚硝酸盐测定波长分别为540、550、540 nm。

图1 亚硝酸盐的检测波长Fig.1 Visible absorption spectra of nitrite detected with three new diazo-coupling reagents

2.2 亚硝酸盐的检测条件

2.2.1 酸性介质及其浓度的影响

由于0.7 mol/L的丁二酸溶液配制3 种重氮试剂时过饱和，因此图2中无该浓度丁二酸对亚硝酸盐吸光度的影响。酸性介质的种类和浓度对亚硝酸盐的吸光度均有影响，可能是酸性介质的酸度系数和溶剂pH值不同所导致[21]。由图2可知，当DS组、DT组、HA组分别以0.3 mol/L丁二酸、0.5 mol/L苹果酸、0.5 mol/L酒石酸为酸性介质时，亚硝酸盐的吸光度分别达到最大。因此，选择0.3 mol/L丁二酸、0.5 mol/L苹果酸和0.5 mol/L酒石酸分别为DS组、DT组、HA组的酸性介质。

图2 DS组（A）、DT组（B）、HA组（C）的酸性介质及其浓度对亚硝酸盐吸光度的影响Fig.2 Influence of acid medium type and concentration on nitrite absorbance detected with ASA-NED (A), AAP-NED (B) and SN-NED (C)

2.2.2 重氮试剂质量浓度的影响

由图3可知，随着对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮质量浓度的升高，亚硝酸盐的吸光度先增加再趋于平稳，可能是重氮试剂在低质量浓度时，重氮化反应不完全，当亚硝酸盐消耗完全时，形成的重氮化合物含量不再增加，吸光度趋于平稳。对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别在10、8、6 g/L后，亚硝酸盐的吸光度无显著差异，因此选择对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6 g/L。

图3 重氮试剂质量浓度对亚硝酸盐吸光度的影响Fig.3 Effect of diazonium reagent concentration on absorbance of nitrite

2.2.3 重氮-偶合试剂体积比的影响

由图4可知，3 组试剂的亚硝酸盐吸光度均随重氮-偶合试剂体积比的增加而先增加后降低，可能是过高的重氮-偶合试剂体积比或当偶合试剂体积高于重氮试剂时，降低反应摩尔消光系数[26]。DS组和HA组的吸光度在重氮-偶合试剂体积比分别为4∶1和3∶1时最大；重氮-偶合试剂体积比为2∶1、3∶1、4∶1时，DT组的吸光度较高且无显著性差异，因此，选择DS组、DT组、HA组的体积比分别为4∶1、2∶1、3∶1。

图4 重氮-偶合试剂体积比对亚硝酸盐吸光度的影响Fig.4 Influence of volume ratio of diazo to coupling reagent on absorbance of nitrite

2.2.4 反应时间的影响

由图5可知，反应时间在3～21 min范围内，DS组、DT组、HA组的吸光度均随反应时间的延长而先升高后趋于稳定，DS组和DT组的吸光度均在反应15 min后无显著差异，HA组的吸光度在反应6 min后无显著变化，因此，选择DS组、DT组、HA组的反应时间分别为15、15、6 min，较GB法规定的20 min分别节省5、5、14 min，因此本法有利于提高效率。

图5 反应时间对亚硝酸盐吸光度的影响Fig.5 Effect of reaction time on absorbance of nitrite

2.2.5 盐酸萘乙二胺质量浓度的影响

由图6可知，随着盐酸萘乙二胺质量浓度的增加，DT组和HA组的亚硝酸盐的吸光度先升高后降低，DS组不断降低，可能由于重氮试剂的不同导致；当盐酸萘乙二胺的质量浓度过高时，溶液酸性增加，亚硝基在强酸条件下不稳定[27]，导致颜色变浅，吸光度降低。DT组的吸光度在盐酸萘乙二胺的质量浓度为0.3～0.7 g/L之间较高且无显著差异；HA组在盐酸萘乙二胺质量浓度为0.5 g/L时吸光度最大，因此，选择DS组、DT组、HA组的盐酸萘乙二胺质量浓度分别为0.1、0.3、0.5 g/L。

图6 盐酸萘乙二胺质量浓度对亚硝酸盐吸光度的影响Fig.6 Influence of NED concentration on absorbance of nitrite

2.2.6 正交试验优化结果

由表4～6可知，DS组、HA组、DT组的理论最优组合分别为A1B2C3D2、H3B1J3D3，T3B3P3D3；即DS组为对氨基苯磺酸质量浓度9 g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1 g/L、丁二酸浓度0.4 mol/L、重氮-偶合试剂体积比4∶1；HA组为磺胺质量浓度9 g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4 g/L、酒石酸浓度0.6 mol/L、重氮-偶合试剂体积比4∶1；DT组为对氨基苯乙酮质量浓度7 g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4 g/L、苹果酸浓度0.6 mol/L、重氮-偶合试剂体积比3∶1。在3 组试剂的理论最优组合进行验证实验，得出DS组、HA组、DT组吸光度分别为0.072、0.070、0.073，均与各自的对照组无明显差异，表明DS组、HA组、DT组的理论最优组合可靠。

表4 DS组正交试验设计及结果Table 4 Orthogonal array design with experimental results for optimization of ASA-NED method

表5 HA组正交试验设计及结果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of AAP-NED method

表6 DT组正交试验设计及结果Table 6 Orthogonal array design with experimental results for optimization of SN-NED method

2.3 亚硝酸盐检测试剂的检测性能

2.3.1 检出限和线性范围

按照DS组、HA组、DT组的最优组合，研究各组试剂的检测范围和线性范围并计算检出限，结果如图7所示。由图7A1、B1、C1可知，测定0～6 μg/mL的亚硝酸盐时，DS组、HA组、DT组的吸光度均随亚硝酸盐质量浓度的增加而增大，当亚硝酸盐质量浓度高于4 μg/mL时，吸光度增加平缓，表明亚硝酸盐质量浓度过高时，应适当稀释后再进行测定；由图7A2、B2、C2可知DS组、HA组、DT组的线性范围分别为0.02～3、0.02～3、0.02～3.4 μg/mL，R2分别为0.999 2、0.999 5、0.999 0，表明3 组试剂均适用于亚硝酸盐的测定，DT组的线性范围最广；采用3δ法计算出DS组、HA组、DT组的检出限分别为0.82、0.51、0.76 mg/kg，与GB法规定的1 mg/kg检出限相比，表明3 组试剂均有较低的检出限。

图7 DS组（A）、HA组（B）、DT组（C）的检测范围和线性范围Fig.7 Detection ranges and linear ranges of ASA-NED (A),AAP-NED (B) and SN-NED methods (C)

2.3.2 抗干扰能力

由表7可知，在5%的相对误差内，GB法抗D-异抗坏血酸钠、半胱氨酸、山梨酸钾浓度干扰的能力分别达亚硝酸盐浓度的20、10、1 000 倍，表明D-异抗坏血酸钠和半胱氨酸对亚硝酸盐含量测定的干扰较大，其原因可能为D-异抗坏血酸钠具有较强的抗氧化性，将NO2-还原为NO，半胱氨酸含有的巯基与NO2-反应生成巯代亚硝酸酯[28-29]。与GB法相比，DS组、HA组、DT组抗D-异抗坏血酸钠浓度干扰的能力分别达20、10、10 倍，抗半胱氨酸浓度干扰的能力分别达10、50、50 倍，且几乎不受苯甲酸钠、山梨酸钾、安赛蜜、葡萄糖、谷氨酸、丙氨酸、草酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸的干扰，表明DS组、HA组、DT组对防腐剂、甜味剂、有机酸均有较高的抗干扰能力，其中DS组与GB法的抗干扰能力相当，HA组和DT组的综合抗干扰能力较高于GB法，表明HA组和DT可针对性的应用于酱腌菜中亚硝酸盐含量的测定。

表7 抗共存物干扰能力Table 7 Resistance to coexisting substances

2.3.3 准确度和精密度

由表8可知，GB法测定15 种酱腌菜样品的回收率在88.61%～92.66%之间，RSD均小于5%。与GB法相比，除了海带样品外，DS组、DT组、HA组的回收率分别为84.04%～87.00%、96.01%～99.60%、93.82%～96.24%，RSD均低于5%，表明DT组和HA组准确度较高，实验条件精密度良好，重复性较好[30]。

表8 GB法、DS组、HA组、DT组的回收率和精密度Table 8 Recoveries and precision RSDs of the traditional and modified methods%

2.4 实际样品的测定

由表9可知，不同酱腌菜品种之间，亚硝酸盐含量存在差异，GB法测得15 种酱腌菜样品的亚硝酸盐含量在（0.87±0.02）～（3.53±0.12）mg/kg之间，远低于GB法中20 mg/kg的限量标准。与GB法相比，除海带样品外，优化后的DT组和HA组的测定结果与GB法无显著差异，而DS组的测定结果与GB法差异显著，其原因可能为DS组受酱腌菜中的D-异抗坏血酸钠[31]、葱、姜、蒜、等香辛料成分[32-33]的干扰影响较大，表明DT组和HA组的测定结果比DS组准确可靠。海带样品的测定结果差异较大的原因可能为海带含有的碘成分与亚硝酸盐反应生成NO或NO3-[34-35]，其原因也可能为I-与重氮-偶合试剂存在某种反应，表明DT组和HA组适用于测定除海带样品外的酱腌菜中亚硝酸盐含量。

表9 样品中亚硝酸盐含量的测定比较Table 9 Comparison of the determination of nitrite contents in real samples by the traditional and modified methods mg/kg

2.5 HA组和DT组的贮存稳定性

根据2.3、2.4节的结果，研究HA组和DT组在25、4、30、40 ℃的避光贮存稳定性。由图8A可知，在贮存40 d的过程中，HA组在25、4、30、40 ℃均表现出良好的稳定性；由图8B可知，DT组仅在4 ℃保持良好的稳定性，当贮存时间超过30 d后，DT组在25、30、40 ℃的亚硝酸盐吸光度明显降低，表明HA组和4 ℃的DT组均可稳定贮存40 d，但HA组比DT组的贮存稳定性好。

图8 HA组（A）和DT组（B）的贮存稳定性Fig.8 Storage stability of AAP-NED (A) and SN-NED (B)

3 结 论

本实验以GB的分光光度法作对照，采用正交试验优化3 组亚硝酸盐检测试剂（DS组、DT组、HA组）代替GB法中的重氮-偶合试剂测定酱腌菜中亚硝酸盐的含量。结果表明：本方法比GB法缩短5～14 min的检测时间，具有更高的效率；DS组、HA组、DT组的酸性介质，丁二酸、酒石酸和苹果酸均可有效代替GB法中的浓盐酸作酸性介质，提高安全性；DS组、HA组、DT组的检测线性范围分别在0.02～3、0.02～3、0.02～3.4 μg/mL之间，检出限分别为0.82、0.51、0.76 mg/kg，低于GB法1 mg/kg的检出限标准；在抗干扰能力方面，DS组、HA组、DT组对防腐剂、甜味剂、有机酸均有较高的抗干扰能力，其中DS组与GB法的抗干扰能力相当，HA组和DT组的综合抗干扰能力较高于GB法；测定15 种不同品种酱腌菜中亚硝酸盐含量时，DT组和HA组的测定结果与GB法无显著差异，RSD值均小于5%，DS组测定结果与GB法差异显著；除含碘量较高的海带样品外，准确度大小关系为：DT组（96.01%～99.60%）＞HA组（93.82%～96.24%）＞GB法（88.61%～92.66%）＞DS组（84.04%～87.00%）；其中HA组和4 ℃的DT组均可稳定贮存40 d。综上，DT组和HA组均展现出优良的检测能力，可有效提高分光光度法的效率和安全性，为酱腌菜中亚硝酸盐的快速定量检测提供理论参考。